Analysis & Purification of Therapeutic Oligonucleotides: Method development optimization from the analytical scale through semi-prep and preparative purification

Význam tématu

Oligonukleotidy představují klíčovou třídu terapeutických molekul, které ovlivňují genovou expresi. Analytická a purifikační kontrola těchto látek je nezbytná pro vývoj a výrobu bezpečných a účinných léčiv. Liquid chromatografie umožňuje efektivní separaci cílových produktů od příbuzných nečistot, což je zásadní krok v celém vývojovém procesu.

Cíle a přehled studie / článku

Studie se zaměřuje na vývoj a optimalizaci metod iontově pár-reverzní fáze (IP-RP) pro analýzu a purifikaci terapeutických oligonukleotidů v měřítku od analytického až po preparativní. Hlavní body:

• Optimalizace chromatografických podmínek – výběr iontově párných činidel a teploty kolony.
• Škálovatelnost metod z analytické na semi-prep a preparativní úroveň.

Použitá metodika a instrumentace

Analytické separace probíhaly technikou iontově pár-reverzní fáze s alkylaminy (TEA, TPA, HA, DBA) na C18 fázích. Zvýšená teplota (60 °C) snižuje sekundární interakce a viskozitu eluční fáze, což zlepšuje rozlišení. Pro škálování byly použity Agilent AdvanceBio Oligonucleotide kolony založené na Poroshell částicích s novelní povrchovou úpravou odolnou vůči vysokému pH a teplotě. Instrumentace: Agilent HPLC systém vybavený topnými kapacitami a semi-preparativními moduly.

Hlavní výsledky a diskuse

Zvýšení teploty z 25 °C na 60 °C vedlo k ostrým a lépe rozlišeným píkům plné délky produktu. U semi-preparativní metody na koloni 10×150 mm byla využita gradience pro zaostření vzorku a čtyřnásobná injekce 160 µL (3,2 mg). Sbírané frakce vykázaly následující výsledky:

• Frakce F08: čistota 99,2 %, výtěžek 33,4 %
• Frakce F09: čistota 98,9 %, výtěžek 25,9 %
• Frakce F10: čistota 97,9 %, výtěžek 20,2 %
• Frakce F07: čistota 65,2 %, výtěžek 9,4 %
• Další frakce: klesající parametry čistoty a výtěžku.

Přínosy a praktické využití metody

• Rychlá a opakovatelná optimalizace analytických metod pro různé typy oligonukleotidů.
• Jednoduché přenesení metody z analytické do semi-prep a preparativní fáze bez změny chemie kolony.
• Možnost purifikace vzorků od bench-top výzkumu až po přípravu klinických dávek.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se další rozvoj stacionárních fází odolných extrémním podmínkám, integrace online detekce hmotnostní spektrometrií a nasazení strojového učení k automatickému návrhu optimálních metod. Zvýšený důraz bude kladen na zrychlení QC procesů a škálovatelnou výrobu oligonukleotidových léčiv.

Závěr

Agilent AdvanceBio Oligonucleotide kolony umožňují vysoké rozlišení a reprodukovatelnost analytických i purifikačních metod. Konzistence chemie a částic usnadňuje přenos analytických podmínek do semi-preparativního a preparativního měřítka, čímž podporuje efektivní vývoj a výrobu terapeutických oligonukleotidů.

Reference

1. Superficially Porous Columns for Semi-Preparative Purification of Synthetic Oligonucleotides, Agilent Technologies application note 5994-7478EN (2024).
2. Fast and Selective Purification of Oligonucleotides Using Preparative HPLC/MS and Software Support, Agilent Technologies application note 5994-4877EN (2022).