Salt gradient separation of nucleic acid components in Adeno-Associated Virus using anion exchange chromatography

Význam tématu

Analýza obsahu a integrity genomu vektorů adeno-asociovaného viru (AAV) je klíčová pro zajištění účinnosti, bezpečnosti a konzistence v terapiích genové terapie.
Metoda aniontové výměnné chromatografie (AEX) nabízí rychlou kvantifikaci genomu v kapsidu i ověření integrity uvolněného DNA, což výrazně zkracuje dobu přípravy vzorku a zvyšuje spolehlivost výsledků.

Cíle a přehled studie

Hlavním cílem bylo vyvinout a validovat AEX metodu pro:

• Rychlou kvantifikaci genomového obsahu v AAV6 před digescí kapsidu.
• Analýzu integrity uvolněného ssDNA genomu po rozpuštění kapsidu pomocí Proteinázy K.

Studie byla rozdělena na dvě části: kvantifikace encapsidovaného genomu a separace uvolněné DNA pro hodnocení integrity.

Použitá metodika a postup

Použitá kolona: ProPac 3R SAX (4,0×100 mm, 3,0 µm).
Mobilní fáze:

• Fáze A: 100 mM Tris-HCl
• Fáze B: 0,8 M NaClO₄
• Fáze C: voda

Gradientní program iniciuje na 20 % A a 80 % C, postupně navyšuje podíl B až na 80 % a vrací se na počáteční podmínky.
Detekce:

• UV při 260 nm a 280 nm (DAD, 3D oblast 200–400 nm).
• Fluorescence (excitace 280 nm, emise 330 nm).

Teploty:

• Kolona: 50 °C pro kvantifikaci, testováno i 40 °C.
• Autosampler: 10 °C.

Flow rate 0,3 mL/min, injekce 5 µL, automatické praní injekcí 10 % methanol.

Hlavní výsledky a diskuse

1. Kvantifikace encapsidovaného genomu:

• Linearita 4 bodů při ředěních 1:1 až 1:10, koeficient kalibrace 0,99979.
• Výborné rozlišení a intenzita píků zajišťující přesné stanovení GC/mL.

2. Analýza integrity uvolněné DNA:

• Tři hlavní frakce: ssDNA, částečná DNA a nadměrná DNA elutují při 13,2, 13,8 a 14,2 min.
• Poměr absorbancí 260/280 nm potvrzuje čistotu DNA frakcí.
• Fluorescenční data ukazují pokles kapsidového proteinu s časem digesce, UV signál DNA narůstá.
• Komparativní elektroforéza v alkalickém agaroze gelu potvrdila chromatografické výsledky.

3. Optimalizace podmínek:

• NaClO₄ jako eluent zajistil nejlepší separaci oproti TMAC a NaCl.
• Vyšší teplota kolony zvýšila retenční časy v souladu se změnou konformace ssDNA.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda AEX pro AAV genom:

• Rychlá příprava vzorku (do 1 h).
• Vysoká citlivost a reprodukovatelnost.
• Vhodná pro QC laboratoře i výzkumné projekty genové terapie.

Použitá instrumentace

• Vanquish Flex Binary system (Vanquish Base, Quaternary Pump F, Sampler F, Column Compartment H).
• Vanquish Diode Array Detector HL a Fluorescence Detector C (Dual-PMT).
• Chromeleon 7.3.1 CDS pro akvizici a analýzu dat.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se rozšíření AEX metod na další serotypy AAV a jiné virové vektory.
Možné kombinace s masovou spektrometrií pro detailní proteomické a genomické charakterizace.
Automatizace přípravy vzorků a integrace do on-line QC platforem.

Závěr

Vyvinutá AEX metoda pro analýzu genomu AAV6 umožňuje rychlou a přesnou kvantifikaci encapsidovaného DNA a detailní hodnocení integrity uvolněných DNA frakcí. Použití NaClO₄, optimalizovaná teplota kolony a moderní detekční systémy zajišťují vynikající rozlišení a reprodukovatelnost, což je zásadní pro aplikace v genové terapii.

Reference

1. Martinez-Fernandez de la Camara C., McClements M.E., MacLaren R.E. Accurate Quantification of AAV Vector Genomes by Quantitative PCR. Genes. 2021; doi:10.3390/genes12040601.
2. Mayginnes J.P. et al. Quantitation of encapsidated recombinant adeno-associated virus DNA in crude cell lysates and tissue culture medium by quantitative, real-time PCR. Journal of Virological Methods.
3. Thermo Fisher Scientific. Genomic DNA Isolation Kits Technical Resources.
4. Vesnaver G., Breslauer K.J. The contribution of DNA single-stranded order to the thermodynamics of duplex formation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1991;88:3569–3573.