Automated online protein-ligand binding and its detection using native mass spectrometry

Význam tématu

Native mass spectrometry (nMS) umožňuje zachovat a detekovat nekovalentní komplexní interakce protein–ligand v jejich přirozeném stavu. Tato schopnost je zásadní pro screening molekulových glue (MG), které stabilizují slabé vazby mezi cílovými proteiny a ubikvitinovou ligázou E3, a tím otevírají nové možnosti pro cílenou degradaci proteinů považovaných za „undruggable“.

Cíle a přehled studie / článku

Studie představuje vývoj plně integrovaného LC–nMS workflow s online výměnou pufru a automatickou frakční kolekcí. Cílem bylo umožnit vysokopropustné, automatizované měření vazeb protein–ligand a detekci ternárních komplexů E3–MG–cílový protein. Testovacími systémy byly Carbonic Anhydrase (CA) s modelovými ligandy a komplex CRBN–DDB1 s řadou molekulových glue.

Použitá metodika a instrumentace

• Online buffer exchange (OBE) a post-column binding pro zachování komplexů po chromatografii.
• Automatizovaná frakční kolekce do 96-jamkové destičky s řízenou teplotou.
• Direct infusion do nMS pro eliminaci offline úprav a minimalizaci disociace.
• LC systém Thermo Scientific Vanquish: UV detektor, dualní Flex pumpy, autosampler, fraction collector.
• Mass spektrometry: Q-Exactive UHMR (m/z 350–80 000) a Orbitrap Ascend Structural Biology edition (m/z 50–16 000), schopné natívní top-down analýzy a fragmentace (CID/HCD/ETD/UVPD, PTCR).

Hlavní výsledky a diskuse

• Porovnání pre-column a post-column bindingu ukázalo, že on-column vazba vede k disociaci slabších ligandů (Kd>10 µM), zatímco post-column nastavení umožňuje jejich detekci.
• Test 4 ligandů na CA (L1–L4) potvrdil korelaci mezi relativní abundancí komplexů a publikovanými hodnotami Kd (L4 nejvyšší vazba, L1 nejnižší).
• Screening 5 molekulových glue (A1–E1) pro komplex CRBN–DDB1–cílový protein odhalil silné glues s Kd v řádu stovek nM a schopnost rychlé detekce během 10minutové frakční kolekce.
• Celková propustnost se výrazně zvýšila díky přímé integraci frakcí do nMS bez offline kroků, čímž se minimalizovala degradace komplexů.

Přínosy a praktické využití metody

• Umožňuje rychlý a spolehlivý screening velkých knihoven ligandů a MG s flexibilním rozsahem afinit.
• Metoda zachovává nekovalentní interakce a poskytuje kvantitativní odhad Kd v reálném čase.
• Vhodné pro farmaceutický výzkum, objevování PROTACs a charakterizaci protein–protein interakcí.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření na multiplexní screening více cílů v jednom běhu pro zvýšení propustnosti.
• Integrace strojového učení a pokročilé analýzy dat pro automatickou interpretaci spekter.
• Miniaturizace frakčních kolektorů a použití microfluidních modulů pro snížení spotřeby vzorku.
• Propojení s in silico předpovědí strukturálních komplexů pro cílenější výběr ligandů.

Závěr

Integrované LC–nMS workflow s on-line výměnou pufru a frakční kolekcí představuje efektivní platformu pro vysokopropustný screening ligandů a molekulových glue. Umožňuje rychlou detekci nekovalentních komplexů, přesné stanovení vazebných konstant a významně přispívá k výzkumu cílené degradace proteinů.

Použitá instrumentace

• Thermo Scientific Vanquish LC: UV detektor, 96-jamková frakční kolekce, dualní autosampler, Flex pumpy.
• Thermo Scientific Q-Exactive UHMR a Orbitrap Ascend Structural Biology edition pro natívní MS a top-down analýzu.