High-throughput high-resolution data-independent acquisition workflow on an Orbitrap Exploris 480 mass spectrometer for accurate label-free quantitation

Význam tématu

Label-free kvantitativní proteomika založená na data-independent acquisition (DIA) na vysokorozlišovacích Orbitrap Exploris 480 přístrojích umožňuje rychlé a reprodukovatelné měření tisíců proteinů současně. Optimalizace DIA protokolů pro různé délky chromatografických gradientů (60, 30, 9 minut) je klíčová pro vysokou průchodnost vzorků bez ztráty hloubky proteomického pokrytí a kvantitativní přesnosti.

Cíle a přehled studie / článku

Hlavním cílem bylo navrhnout a validovat tzv. Velocity DIA workflow pro label-free kvantitaci na Orbitrap Exploris 480 MS v kombinaci s Vanquish Neo UHPLC a µPAC Neo kolonkou. Studie porovnala dvě režimy nastavení: maximální identifikace (Max ID) a maximální kvantita (Max Quan) při gradientech 9, 30 a 60 minut. Pro modelové testy byly použity standardy HeLa, E. coli a kvasinkové proteiny v různých poměrech.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky HeLa, E. coli a kvasinek byly připraveny ve 0,1 % kyselině mravenčí a smíchány v poměrech 325 ng, 100–25 ng a 75–150 ng. Rozdělení gradientů:

• Ultra-high throughput: 9 minut
• Krátký průchod: 30 minut
• Dlouhý průchod: 60 minut

Chromatografie: přímá injekce na 50 cm µPAC Neo kolonce, Vanquish Neo UHPLC, průtok 350 nL/min.
Hmotnostní spektrometrie: Orbitrap Exploris 480 v DIA módu, volitelně s rozhraním FAIMS Pro (napětí –45 V).
Softwarové zpracování: Spectronaut (v18) s directDIA, DIA-NN (v1.8.1), Proteome Discoverer (v3.1.0.618) s CHIMERYS.

Hlavní výsledky a diskuse

Gradient 9 minut (Max ID) umožnil detekci přes 5 500 proteinových skupin s dobrou kvantitativní reprodukovatelností. Režim Max Quan poskytl vyšší přesnost kvantifikace (CV ~6 %) i při extrémně rychlém průchodu.
Gradient 30 minut vedl k >6 300 identifikovaným proteinům (CV ~5 %) a umožnil vyváženost mezi hloubkou pokrytí a průchodností.
Gradient 60 minut odhalil více než 7 400 proteinů s vynikající přesností (<4 % CV) díky vyšší kapacitě nálože (500 ng).
Aktivace FAIMS Pro vedla k ~5% zvýšení počtu identifikovaných proteinů, ale s mírným snížením pokrytí peptidů.
Analýza tříproteomové směsi prokázala věrné zachycení očekávaných poměrů lidských, bakteriálních a kvasinkových proteinů.

Přínosy a praktické využití metody

Díky kombinaci krátkých i dlouhých gradientů a spolupráci s automatizovaným AccelerOme platformou lze dosáhnout:

• Vysokopropustného screeningu biomarkerů
• Monitoringu proteinových změn v biotechnologii a farmacii
• Analýzy složitých bakteriálních a kvasinkových vzorků s vysokou citlivostí
• Minimalizace operátorských variací díky automatizaci přípravy vzorků

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekávané směry rozvoje zahrnují:

• Integrované multi-omics workflow kombinující proteomiku s lipidomikou a metabolomikou
• Využití umělé inteligence pro prediktivní optimalizaci DIA parametrů
• Rozšíření FAIMS technologií pro selektivnější filtraci iontů
• Aplikace v klinických studiích s ultra-nízkou náloží vzorků, včetně biopsií a tekuté biopsie

Závěr

Velocity DIA workflow na Orbitrap Exploris 480 v kombinaci s µPAC Neo UHPLC nabízí vyvážené řešení pro vysokou průchodnost i hloubku proteomického pokrytí. Optimalizované gradienty, volitelná FAIMS Pro a pokročilý softwarový arsenál zajišťují robustní a přesnou label-free kvantitaci pro potřeby akademického i průmyslového výzkumu.

Reference

Kevin Yang, Julia Kraegenbring, Jingjing Huang, Julian Saba, Amirmansoor Hakimi: High-throughput high-resolution data-independent acquisition workflow on an Orbitrap Exploris 480 mass spectrometer for accurate label-free quantitation. Thermo Fisher Scientific, 2024.