PEGS: SIMPLE AND AUTOMATABLE SAMPLE PREPARATION FOR TRYPTIC PEPTIDE MAPPING WITH THE PEPTIDEWORKS KIT

Význam tématu

Peptidová analýza pomocí tryptické digesce je kritickým krokem při charakterizaci terapeutických proteinů a pro kontrolu kvality. Spolehlivá a reprodukovatelná příprava vzorku minimalizuje vznik metodou indukovaných modifikací, zajišťuje úplné štěpení a zabraňuje autolýze trypsinu.

Cíle a přehled studie / článku

Studie prezentuje pracovní postup pro rychlou, robustní a automatizovatelnou přípravu vzorků pomocí soupravy PeptideWorks Kit od společnosti Waters. Hlavním cílem bylo porovnat manuální a robotizovanou přípravu, vyhodnotit účinnost digesce, opakovatelnost a míru nevhodných štěpení a metodou indukovaných modifikací.

Použitá metodika a instrumentace

• Souprava: PeptideWorks Tryptic Protein Digestion Kit založená na enzymu RapiZyme Trypsin
• Automatizace: Andrew+ Pipetting Robot
• Chromatografie: ACQUITY UPLC I-Class PLUS System
• Detektory: ACQUITY RDa Detector, Xevo G2 XS Mass Spectrometer
• Kolony: ACQUITY Premier Peptide CSH C18 1.7 µm (2.1×150 mm), XSelect Premier Peptide CSH C18 2.5 µm (2.1×150 mm)

Hlavní výsledky a diskuse

• Obě verze přípravy (manuální i automatizovaná) dosahují kompletní digesce s pokrytím sekvence >88 % a podílem chybějících (missed) a nespecifických štěpení pod 5 %.
• Opakovatelnost denní přípravy byla <15 % RSD pro nepoškozené peptidy a <10 % RSD pro modifikované peptidy.
• Test peptidované ADC (Trastuzumab emtansine) odhalil specifické peptidové izomery a změny ve většině retenční oblasti, potvrzené hmotnostní analýzou.
• Srovnání s vedoucí soupravou založenou na immobilizovaném trypsinu ukázalo 93 % redukci chybějících štěpení a 55 % snížení nespecifických štěpení.

Přínosy a praktické využití metody

• Zkrácená doba přípravy vzorků pod 2,5 hodiny pro 24 vzorků.
• Vysoká účinnost digesce bez nutnosti zvýšené teploty.
• Minimální vznik metodou indukovaných modifikací (deamidace, oxidace).
• Kompatibilita s analýzou klasických monoklonálních protilátek i ADC.
• Podpora automatizace zvyšuje propustnost a konzistenci laboratorních procesů.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace s nejnovějšími robotizovanými platformami pro vysokopropustné zpracování vzorků.
• Rozšíření aplikací na další bioterapeutické molekuly a komplexní proteomické studie.
• Využití umělé inteligence a strojového učení pro pokročilou analýzu peptidových dat a rychlejší identifikaci modifikací.
• Možné úpravy protokolu pro kvantitativní analýzy a monitorování stability léčiv v reálném čase.

Závěr

PeptideWorks Kit poskytuje robustní, rychlý a plně automatizovatelný přístup k přípravě vzorků pro tryptickou peptidovou analýzu. Vysoká konzistence, snížený výskyt chybějících a nespecifických štěpení a nízké denní variace modifikací potvrzují jeho vhodnost pro rutinní charakterizaci terapeutických proteinů včetně ADC.

Reference

• Hanna C.M., Yang H., Danaceau J.P., Koza S.M., Shiner S., Trudeau M. Simple and Automatable Sample Preparation for Tryptic Peptide Mapping with the PeptideWorks Kit. Waters Corporation, 2024.