Two Dimensional HPLC using a High pH Stable Superficially Porous Column

Význam tématu

Chromatografická analýza stopových nečistot a strukturně podobných látek je nepostradatelná pro spolehlivé stanovení čistoty cílových sloučenin a zajištění kvality farmaceutických a chemických produktů.

Cíle a přehled studie

Cílem práce bylo ukázat možnosti dvoudimenzionální HPLC (2D-LC) pomocí tzv. heart-cuttingu při využití sloupců Poroshell HPH stabilních při vysokém pH.
Autoři porovnali ortogonalitu separací při různých pH mobilních fází a demonstrovali plnou rezoluci koelutujících špiček přenosovým ventilem.

Použitá metodika a instrumentace

• Systém Agilent 1290 Infinity 2D-LC s moduly: G1329A autosampler, G1311A čtyřsložková pumpa, G1315C DAD (1. dimenze), G4220A pumpa, G1316C termostatická komora a 4-port duo ventil (G4236A), G4212A DAD (2. dimenze), OpenLab C1.04.
• Sloupce: Poroshell HPH C18 (2,1×100 mm, 2,7 μm) pro vysoké pH a Poroshell 120 EC-C18 pro pH 3–4,8.
• Mobilní fáze: 10 mmol/l amonný uhličitan (pH 10), formiát/amoniak pH 3/4,8; organika: methanol nebo acetonitril; gradientní programy odpovídající 1. a 2. dimenzi.
• Pro doplňující jednorozměrné studie: Agilent 1260 s Hi-ALS, binární pumpou, termostatickou komorou, DAD a OpenLab C1.05.

Hlavní výsledky a diskuse

• Poroshell HPH sloupce prokázaly stabilitu až do pH 10 po více než 40000 kolonech objemu.
• Korelaci retenčních časů mezi pH 3–4,8 vykazoval EC-C18 sloupec vysoké R2 (~0,94), zatímco mezi pH 3–10 již nižší korelaci (~0,46), což potvrzuje vyšší ortogonalitu při větším pH rozdílu.
• Podobné trendy byly pozorovány i při použití acetonitrilu (R2 = 0,79 mezi 3/4,8 a R2 = 0,35 mezi 3/10).
• Heart-cutting 2D-LC umožnil plné rozlišení koelutujících nečistot, nacházejících se v rozmezí 3,2–3,3 min 1. dimenze, a odhalil další složku.
• Aplikace na směs amfetaminů a dalších kyselých, zásaditých i neutrálních látek potvrdila zlepšenou retenci zásaditých sloučenin a ostřejší tvary špiček při vysokém pH.

Přínosy a praktické využití metody

• Možnost zvýšit selektivitu a ortogonalitu separací bez výměny fáze.
• Kratší doba metodového vývoje díky jednoduché volbě pH mobilních fází.
• Zlepšení rozlišení nečistot a vyšší citlivosti díky ostřejším špičkám a lepší retenci.
• Flexibilita v aplikacích QA/QC, farmaceutickém vývoji, průmyslové analytice a výzkumu.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se další rozvoj 2D-LC automatizace, integrace pH-stabilních materiálů s dalšími separačními principy (např. iontová chromatografie, kapilární elektroforéza) a rozšíření do bioanalytických a environmentálních aplikací.

Závěr

Dvoudimenzionální HPLC s pH-stabilním Poroshell HPH C18 sloupcem nabízí vysoce ortogonální separace, robustní provoz při širokém pH rozsahu a efektivní rozlišení koelutujících složek. Metoda zkracuje vývojovou fázi a zvyšuje kvalitu analytických výsledků.

Reference

• Long W. et al., Two Dimensional HPLC using a High pH Stable Superficially Porous Column, Poster P-W-1923, HPLC 2014, New Orleans.
• Buckenmaier S. et al., Stability of Poroshell HPH Columns at High pH, Poster P-M-0204.