Morpholino antisense oligonucleotides analyses using a compact matrix-assisted laser-desorption/ionization digital-ion-trap mass spectrometer (MALDI-DIT-MS)

Význam tématu

Růst zájmu o antisense oligonukleotidy vyžaduje rychlé a spolehlivé analytické metody pro ověřování kvality a struktury těchto léčiv.
Morpholino antisense oligonukleotidy představují modifikovaný typ oligomerů s vysokou stabilitou a specifitou, ale jejich sekvenční analýza bývá náročná kvůli omezené fragmentaci tradičními metodami.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo ověřit schopnost kompaktního MALDI-DIT-MS přístroje (MALDIminiTM-1) pro hmotnostní a sekvenční analýzu modelových morpholino antisense oligonukleotidů, konkrétně viltolarsenu a eteplirsenu.

Použitá metodika a instrumentace

• Instrumentace: MALDIminiTM-1 (Shimadzu Corp.) s digitálním iontovým pastem (MALDI-DIT-MS).
• Modelové analyty: viltolarsen (MW 6924,82 Da) a eteplirsen (MW 10300,59 Da).
• Příprava vzorku: analyty 20 pmol/µl v akv. roztoku; matrix 3-hydroxypikolinová kyselina/2,4,6-trihydroxyacetofenon (3-HPA/THAP) v acetonitril/voda (50/50, v/v) s 70 mM citrátu amonného; poměr vzorek:matrix 1:1, 1 µl depoze na vzorkovou misku.
• Provozní podmínky: dynodové napětí 8000 V, detektor 1300–1800 V, RF delay 17–25 µs.

Hlavní výsledky a diskuse

• Hmotnostní analýza: za optimálních podmínek bylo u obou analyzovaných oligonukleotidů detekováno [M+H]+ s vysokou citlivostí a reprodukovatelností.
• Sekvenční analýza: v širokém rozmezí hmotnostních fragmentů od nízké až po vysokou m/z byly detekovány fragmenty pokrývající celou sekvenci viltolarsenu i eteplirsenu.
• Identifikovány byly charakteristické fragmenty specifické pro MALDI-DIT-MS, umožňující odvození mechanismu vzniku b-iontů a (x−10)-iontů.

Přínosy a praktické využití metody

• Kompaktní MALDI-DIT-MS nabízí rychlou a snadno dostupnou platformu pro ověřování molekulární hmotnosti a sekvence morpholino antisense oligonukleotidů.
• Metoda umožňuje lokalizaci modifikací a terminálních úprav, což je klíčové pro kontrolu kvality v rámci vývoje terapeutických oligonukleotidů.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace s kapalinovou chromatografií pro zlepšení separace komplexních směsí oligonukleotidů.
• Vývoj pokročilých softwarových nástrojů pro automatizované de novo sekvenování fragmentačních spekter.
• Rozšíření aplikace na další modifikované nukleotidy a nanostruktury v oblasti biotechnologií a kontroly kvality.

Závěr

Studie prokázala, že MALDI-DIT-MS s kombinovanou matricí 3-HPA/THAP je efektivní a citlivá metoda pro rychlou hmotnostní i sekvenční analýzu morpholino antisense oligonukleotidů.
Kompaktní přístroj umožňuje komplexní charakterizaci včetně lokalizace modifikací, což zrychluje a zpřesňuje kontrolu kvality terapeutických oligonukleotidů.

Reference

• Fukuyama Y., Sekiya S., Iwamoto S., Tanaka K. Posterová prezentace na ASMS 2023 (ThP571).
• Karasawa H. et al. Complete sequencing of morpholino antisense oligonucleotides by electron capture dissociation combined with LC-MS. Anal. Chem. 2023;95:16352–16358.