Cost-efficient and scalable end-to-end workflow on the Opentrons OT-2 for neat plasma utilizing Evotip Pure

Význam tématu

Proteomika plazmy představuje klíčový nástroj v biomedicínském výzkumu, umožňující sledovat projevy onemocnění a identifikovat biomarkery v minimálně invazivních vzorcích. Rychlý rozvoj LC-MS technologií zvyšuje nároky na automatizovanou, škálovatelnou a cenově efektivní předúpravu vzorků.

Cíle a přehled studie

Cílem je předvést kompletně automatizovaný end-to-end workflow od surové lidské plazmy až po ready-to-analyze Evotip Pure, provozovaný na robotu Opentrons OT-2. Workflow podporuje současnou přípravu až 192 vzorků během osmi hodin a nabízí intuitivní HTML-form interface pro návrh a standardizaci experimentů v rámci i napříč laboratořemi.

Použitá metodika a instrumentace

Workflow začíná pipetováním 1 µl plazmy do 96-jamkové destičky na OT-2, následovanou jednorázovým redukčně-alkylačním krokem (1 % SDS, 5 mM TCEP, 10 mM CAA v 50 mM TEAB). Proteiny jsou zachyceny pomocí acetronitrilem aktivovaných hydrofobních magnetických kuliček (MagReSyn Hydroxyl) a tráveny in-situ s 10 ng LysC a 40 ng trypsinu po dobu 4 hodin při pokojové teplotě. Po jednom praní s acetonitrilem se 40 % z digestu naloží přímo na Evotip Pure. Analýza probíhá na přístrojích Evosep One (metody 100 SPD a 200 SPD, kolony EV1109/EV1107) v kombinaci s hmotnostním spektrometrem Bruker timsTOF HT v režimu dia-PASEF. Data jsou vyhodnocena softwarem DIA-NN (v.1.8.1) v režimu bez knihovny proti Uniprot-u.

Hlavní výsledky a diskuse

Digestoční účinnost dosahuje ~65 % plně štěpených peptidů, z čehož je identifikováno ~400 proteogroup při CV mediánu 13,4 %. Metoda pokrývá čtyři dekády dynamického rozsahu, včetně FDA schválených biomarkerů. Příprava celé 96-jamkové destičky odhalila ~300 proteinů na vzorek a ~250 proteinů ve více než 95 % analýz. PCA ukázala absenci pozicového zkreslení během pipetace, což potvrzuje vysokou reprodukovatelnost.

Přínosy a praktické využití metody

• Minimální objem vzorku (1 µl plazmy).
• Automatizace kroku redukce, alkylace, čištění a trávení.
• Škálovatelnost až na 192 vzorků/8 h.
• Výrazná úspora enzymů a snížení manuálních úkonů.
• Spolehlivá identifikace a kvantifikace klíčových biomarkerů.

Budoucí trendy a možnosti využití

Integrace pokročilých modulů pro QC a modifikační analýzy, možnost přenosu workflow na jiné robotické platformy pro zvýšení throughputu, vylepšení trávení řízenou teplotou, plná integrace s cloudovými datovými toky a rozšíření o online desalting během naložení peptidů.

Závěr

Navržené řešení na Opentrons OT-2 ve spojení s Evotip Pure nabízí robustní, cenově i časově úspornou automatizaci přípravy plazmových vzorků. S minimálním vzorkem, vysokou reprodukovatelností a snadnou rozšiřitelností představuje pevný základ pro další inovace v protějšcích high-throughput proteomických aplikací.

Reference

1. Batth TS., Tollenaere M., Rüther P., Gonzalez-Franquesa A., Prabhakar BS., Bekker-Jensen S., Deshmukh AS., Olsen JV. Protein Aggregation Capture on Microparticles Enables Multipurpose Proteomics Sample Preparation. Mol Cell Proteomics. 2019; mcp.TIR118.001270.