Scalability for high-throughput proteomics - Evotip Pure integration with the Biomek i5 liquid handler

Význam tématu

Proteomika se stále častěji uplatňuje v rozsáhlých studiích i rutinní analýze díky citlivějším hmotnostním spektrometrům a klinickým aplikacím.
Roste potřeba plně automatizovaných a škálovatelných řešení, která zajistí vysokou propustnost, reprodukovatelnost a nízké náklady na vzorek.

Cíle a přehled studie

Cílem bylo navrhnout a validovat čtyři end-to-end workflow integrovaná v Biomek i5 Automated Liquid Handler v kombinaci s Evotip Pure pro efektivní přípravu vzorků až do LC-MS analýzy.
Workflow zahrnují:

• Evotip Sample Loading pro automatizované odsolení a načtení do trap kolonek
• PAC1 digesční workflow pro on-bead trávení proteinové agregace
• Neat Plasma workflow pro zkrácenou redukci/alkylaci a PAC trávení
• Mag-Net Plasma workflow pro obohacení membránových váčků a následnou PAC digesci

Použitá metodika

Buňky HeLa byly lyzovány v SDS, proteiny redukovány, alkylovány a v případě PAC trávení navázány na magnetické hydroxylyzové částice.
Digesce probíhala pře noc při 37 °C nebo optimalizovaně zkráceně ve třech hodinách.
Plazma byla připravena podle EDRN SOP3; pro Mag-Net workflow se vzorek obohacoval o SAX magnetické částice.
Výsledné peptidy se načítaly na Evotipy s odběrem 40–80 % eluátu.

Použitá instrumentace

• Biomek i5 Automated Liquid Handler (Beckman Coulter)
• 300 µl multikanálová pipetová hlava
• BioShake D30-T elm (Q-Instruments)
• Magnum FLX magnetický modul (Alpaqua)
• Evosep One se sloupcem EV1107 Endurance
• Evotip Pure trap kolony
• timsTOF HT (Bruker) s dia-PASEF MS metodou
• Software DIA-NN v. 1.8.1 v režimu library-free

Hlavní výsledky a diskuse

Vývoj umožnil paralelní zpracování až 576 vzorků (6 destiček) za 18 hodin, tj. průměrně méně než 2 minuty zpracování na vzorek.
Testování ukázalo nulové meziplátkové kontaminace a vysokou reprodukovatelnost s Pearsonovou korelací 0,9–1,0 na úrovni proteinů.
U HeLa vzorků identifikováno až 5 500 proteinů z 1 µg vstupu a CV na úrovni proteinů < 20 %.
Neat plasma workflow odhalil přibližně 500 proteinů z 1 µl vzorku, zatímco Mag-Net enrichment zvýšil hloubku analýzy na 2 700 proteinů, včetně 40 označených v databázi Vesiclepedia, s CV < 20 %.

Přínosy a praktické využití metody

Plně automatizované workflow snižují manuální zásahy a variabilitu, šetří enzymy i vzorek a snižují náklady na vzorek.
Metoda vhodná pro klinické studie, vysokopropustné farmaceutické screeningy i standardizaci QA/QC v průmyslové analytice.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření na další typy vzorků (tkáně, sekrety, buněčné frakce)
• Integrace s AI-podporovanou optimalizací metod
• Pokročilé multiplexní označování a minimalizace objemů
• Implementace do klinických diagnostických linek
• Další miniaturizace a zvýšení autonomie laboratoře

Závěr

Integrace Biomek i5 a Evosep Pure přináší robustní, škálovatelné a vysoce reprodukovatelné řešení pro přípravu vzorků v proteomice.
Workflowy dosahují vysoké propustnosti, hlubokého pokrytí proteomu a nízkých nákladů na vzorek, čímž podporují rozsáhlé výzkumné i průmyslové aplikace.

Reference

1. Batth T.S., Tollenaere M., Rüther P. et al. Protein Aggregation Capture on Microparticles Enables Multipurpose Proteomics Sample Preparation. Mol Cell Proteomics. 2019; mcp.TIR118.001270.
2. Wu C.C., Tsantilas K.A., Park J. et al. Mag-Net: Rapid enrichment of membrane-bound particles enables high coverage quantitative analysis of the plasma proteome. BioRxiv. 2023; 10.1101/2023.06.10.544439v1.
3. Tuck M.K., Chan D.W., Chia D. et al. Standard Operating Procedures for Serum and Plasma Collection: Early Detection Research Network Consensus Statement. J Proteome Res. 2010; 10.1021/pr800545q.