HIGH THROUGHPUT CYSTEINYLATION SCREENING AT MAB SUBUNIT LEVEL USING LC-MS SCREENING WORKFLOW

Význam tématu

Monoklonální protilátky (mAbs) představují klíčovou skupinu bioterapeutik. Přítomnost volných (nepárovaných) cysteinových zbytků ve variabilních oblastech může vést k nechtěným modifikacím (cysteinylace, glutathionylace), stabilitním problémům a agregaci. Rychlé a spolehlivé sledování těchto modifikací je zásadní pro vývoj, kontrolu kvality a uvolňování léčivých protilátek.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem bylo vyvinout a ověřit workflow vysokoprůchodového (high-throughput) screeningu cysteinylace a glutathionylace nepárovaných cysteinů na úrovni subjednotek mAb bez redukce. Studie porovnala referenční (innovator) mAb s řadou biosimilárních vzorků pocházejících z různých výrobních procesů.

Použitá metodika a instrumentace

Analytický přístup se skládal z dvou klíčových částí:

• Non-reduced mAb subunit analysis: Enzym IdeS (FabRICATOR) štěpí protilátku pod ne­redukčními podmínkami na Fc (~25 kDa) a spojenou Fab (Fd’+LC)2 (~100 kDa). Rychlá 5min LC-MS analýza na systému BioAccord LC-MS s kolonkou ACQUITY Premier BEH C4 poskytla rozlišení jednotlivých subjednotek bez interference glykosylace ve Fc.
• Non-reduced targeted peptide mapping: Cílená LC-MS metoda (15 min) na Xevo G3 QTof s ACQUITY Premier CSH C18 kolonkou pro potvrzení lokalizace modifikace na předpokládané nepárované cysteinové pozici ve verižce světelného řetězce.

Použité přístroje a software:

• BioAccord LC-MS System (Waters)
• Xevo G3 QTof Mass Spectrometer (Waters)
• ACQUITY Premier BEH C4 a Premier CSH C18 kolony
• INTACT Mass App a UNIFI informatiky pro automatizované dekonvoluce a zpracování dat
• Reaktivita: iodoacetamid (IAM) pro alkylaci, RapiZyme Trypsin pro doplňkové štěpení

Hlavní výsledky a diskuse

Analýza referenčního vzorku ukázala nízkou úroveň cysteinylace (~4 %) a glutathionylace (~1 %). Biosimilární vzorky vykazovaly rozmezí cysteinylace od ~35 % do ~81 % a glutathionylace od ~10 % do ~60 %. Metoda dosáhla citlivosti na úrovni 0,5 % pro jednotlivé modifikované subjednotky. Cílené peptide mapping potvrdilo lokalizaci modifikace na očekávaném nepárovaném cysteinu (fragment y9). Odstranění Fc zjednodušilo analýzu Fab a zvýšilo spolehlivost kvantifikace.

Přínosy a praktické využití metody

• Rychlé 5min subunit LC-MS měření bez redukce šetří čas i spotřební materiál.
• Odstranění složitosti Fc umožňuje přesnou kvantifikaci nízkých úrovní modifikací ve Fab.
• Automatizované zpracování v INTACT Mass App zkracuje dobu vyhodnocení a minimalizuje lidské chyby.
• Workflow vhodný pro procesní vývoj, kontrolu jakosti (QA/QC) a uvolňovací testy výrobků.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace více atributů (MAM) pro souběžné sledování glykosylace, oxidace a dalších PTM.
• Automatizace a robotizované přípravy vzorků pro zvýšení průchodnosti a reprodukovatelnosti.
• Využití strojového učení pro predikci a rozpoznání vzorců modifikací.
• Rozšíření workflow na jiné třídy bioterapeutik (Fc-fúze, bispecifické mAbs).

Závěr

Popsaný ne­redukční subunit LC-MS přístup umožňuje rychlé, citlivé a robustní screenování nepárovaných cysteinových modifikací v mAb. Metoda poskytuje spolehlivou kvantifikaci již od 0,5 % a potvrzení lokalizace modifikace cílenou peptide mapping analýzou.

Reference

• Liu H, May K. Disulfide bond structures of IgG molecules: structural variations, chemical modifications and possible impacts to stability and biological function. mAbs. 2012;4(1):17–23.
• Biosimilar Basics for Patients. FDA website. Accessed 7 Nov 2023.
• Banks DD et al. Removal of Cysteinylation from an Unpaired Sulfhydryl in the Variable Region of a Recombinant Monoclonal IgG1 Antibody Improves Homogeneity, Stability, and Biological Activity. J Pharm Sci. 2008;97(2):775–790.
• Ippoliti S, Yu YQ, Ranbaduge N, Chen W. Establishment of a Robust mAb Subunit Product Quality Attribute Monitoring Method Suitable for Development, Process Monitoring, and QC Release. Waters Application Note 70007129en. 2021.
• Sokolowska I et al. Subunit mass analysis for monitoring antibody oxidation. mAbs. 2017;9(3):498–505.
• Sokolowska I et al. Implementation of a High-Resolution Liquid Chromatography-Mass Spectrometry Method in Quality Control Laboratories for Release and Stability Testing of a Commercial Antibody Product. Anal Chem. 2020;92:2369–2373.