Precise and accurate real-time de novo sequencing of timsTOF data with the Novor algorithm on the Bruker ProteoScape™ platform

Význam tématu

Real‐time de novo sekvenování peptidů na platformě timsTOF představuje klíčový přístup pro identifikaci netradičních a neočekávaných proteinových úseků, necitlivých na existující databáze. V oblastech jako imunopeptidomika či metaproteomika, kde se setkáváme s unikátními a vzácnými sekvencemi, umožňuje tento přístup odhalit nové peptidové struktury v reálném čase, čímž zkracuje analýzu a zvyšuje citlivost detekce.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo integrovat a optimalizovat algoritmus Novor vyvinutý společností Rapid Novor Inc. přímo do platformy Bruker ProteoScape™ (BPS) pro přístroje timsTOF. Autoři porovnali výkon integrované verze BPS Novor s předchozími verzemi Novor a konkurenčním softwarem („Software A“) na různých experimentech včetně smíšených vzorků lidských, kvasinkových a bakteriálních peptidů a imunopeptidomických dat.

Použitá metodika a instrumentace

• Úprava a trénink algoritmu Novor na rozsáhlé sadě timsTOF dat (přes 1,78 milionu PSM) získaných funkcí PASEF.
• Sledované enzymatické štěpení: trypsin, GluC, pepsin, elastáza, chymotrypsin.
• Pro referenční pravdu použit ProLuCID-GPU vyhodnocený s DTASelect při 1% FDR.
• Offline srovnání pomocí MGF souborů a výpočet přesnosti a recall na úrovni aminokyselin a celých peptidů.
• Hlavní analytické přístroje: Bruker timsTOF s PASEF, platforma Bruker ProteoScape™.

Hlavní výsledky a diskuse

Studie ukázala, že BPS Novor zlepšil správnou identifikaci aminokyselin o průměrných 5 % oproti konkurenčnímu softwaru A a o 11 % oproti nepřetrénované verzi Novor. Navíc zpracování spekter probíhalo až 20× rychleji, což umožňuje udržet krok s rychlostí akvizice PASEF. V imunopeptidomických datech (MHC třídy I) dosáhl BPS Novor vyšší přesnosti a rozpoznal složitější spektra než ostatní algoritmy. Výsledky jsou konzistentní napříč různými druhy organismů, což potvrzuje robustnost přístupu.

Přínosy a praktické využití metody

• Schopnost „Run & Done“ real‐time analýzy bez nutnosti offline zpracování.
• Vysoká přesnost a rychlost ideální pro aplikace s nízkým pokrytím peptidů, například v imunopeptidomice.
• Možnost nasazení v metaproteomice, objevování neočekávaných post‐translačních modifikací, analýza biologických vzorků z prostředí.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se další zdokonalování de novo algoritmů s využitím hlubokého učení pro predikci spektrálních fragmentů, lepší integrace s online rozhodovacími pracovními postupy a propojení s cloudovými platformami pro sdílení a hromadné učení z rozmanitých datasetů. Potenciál se otevírá také v jednovláknové a single‐cell proteomice, kde rychlé a přesné de novo sekvenování významně zvýší informační obsah analýz.

Závěr

Integrace BPS Novor na platformě Bruker ProteoScape™ pro timsTOF přináší významné zrychlení a zvýšení přesnosti de novo sekvenování peptidů. Výsledná robustnost a univerzálnost potvrzují vhodnost použití v náročných aplikacích, zejména v imunopeptidomice a dalších oblastech nekanonální proteomiky.

Reference

• Xu T. et al. ProLuCID‐GPU for high‐throughput database searching. J. Proteome Res., 2015.
• Tabb D. L. et al. DTASelect: validation of shotgun proteomic workflows. Anal. Chem., 2002.
• Ma B. Novor: real‐time peptide de novo sequencing. J. Proteome Res., 2015.
• Prianichnikov N. et al. Mixed‐species timsTOF dataset PXD014777. Proteomics, 2020.
• Feola S. et al. MHC class I immunopeptidomics on timsTOF. Mol. Cell. Proteomics, 2021.