Confident drug metabolite identification using an intelligent data acquisition and processing workflow

Význam tématu

Profilování a identifikace metabolitů léků je klíčové v raných fázích vývoje nových farmak, protože odhaluje biotransformační dráhy, potenciální toxické produkty a farmakokinetické vlastnosti. Moderní přístupy založené na vysokorozlišovací přesné hmotnostní spektrometrii (HRAM MS) umožňují díky vynikající přesnosti hmoty, vysoké rychlosti skenování a rychlému přepínání polarity zachytit stopové úrovně metabolitů v složitých biologických matricích.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo demonstrovat výkonnost inteligentního pracovního postupu pro akvizici dat (AcquireX) na Orbitrap Exploris 240 MS v kombinaci s Vanquish Horizon UHPLC a softwarovým nástrojem Compound Discoverer pro komplexní profilování metabolitů modelových látek nefazodon, montelukast a timolol in vitro v lidských a potkaních jaterních mikrosomech. Studie porovnává tradiční data-dependent acquisition (DDA) s inteligentním AcquireX workflow.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky modelových sloučenin (10 µM) byly inkubovány s jaterními mikrosomy (1 mg/mL) za přítomnosti koenzymů NADPH, UDPGA a GSH po dobu 30 minut. Reakci bylo zastaveno přidáním acetonitrilu (3:1 v/v), vzorky po odstředění deproteinizovány, koncentrovány a doplněny do plazmy (1:5 v/v). Chromatograficky oddělení proběhlo na C18 UHPLC kolonu Hypersil GOLD VANQUISH (2,1 × 50 mm, 1,9 µm, 50 °C) s elucí gradientem na Vanquish Horizon UHPLC systému:

• Vanquish Binary Pump H
• Vanquish Split Sampler HT
• Vanquish Column Compartment H
• Vanquish Diode Array Detector FG

Hmotnostní spektrometrie proběhla na Orbitrap Exploris 240 s OptaMax NG ionizační zdrojem a EASY-IC interní kalibrací. Byly použity dva režimy akvizice: Full MS + Top3 ddMS2 s přepínáním polarity a Full MS + Top5 ddMS2 v pozitivním módu. Inteligentní AcquireX workflow automaticky generovalo exclusion/inclusion listy v reálném čase. Data zpracována v Compound Discoverer 3.2 s přednastaveným workflow „MetID with Stats Expected and Unknown with Background Removal".

Hlavní výsledky a diskuse

• AcquireX výrazně zvýšilo pokrytí MS/MS metabolitů: pro nefazodon bylo detekováno 21 metabolitů místo 10 (nárůst ~110 %), pro montelukast 11 místo 4 a pro timolol 7 místo 5.
• Rychlé přepínání polarity a vysoké rozlišení (60 000 MS, 15 000 MS/MS) s interní kalibrací zajišťují sub-ppm přesnost hmoty a rozlišení izotopových vzorců (např. detekce síry v timololmetabolitu m/z 349,1541).
• AcquireX background exclusion workflow umožnil spustit MS/MS na nízko intenzitních signálech maskovaných matricí, čímž se zvýšila účinnost identifikace o 30–50 % oproti konvenční DDA.
• Software Compound Discoverer automaticky předpovídal očekávané metabolity i neočekávané biotransformace, podporoval anotaci fragmentů (FISh scoring) a vyhledávání na základě izotopových vzorců (Pattern Scoring) a tříd sloučenin (Class Coverage).

Přínosy a praktické využití metody

• Zvýšená citlivost a selektivita identifikace nízkoabundantních metabolitů.
• Automatizovaná a integrovaná akvizice a zpracování dat minimalizuje čas a ruční zásahy.
• Užití v preklinických studiích metabolizmu, toxikologii a farmakokinetice.
• Možnost rychlého nasazení v QA/QC laboratořích a farmaceutickém průmyslu.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření inteligentních akvizičních strategií (např. hluboké skenování, iterativní vylučování) pro ještě komplexnější profilování.
• Integrace umělé inteligence a strojového učení pro automatizovanou interpretaci metabolomických dat.
• Aplikace v oblasti biomarkerů, personalizované medicíny a metabolomiky potravin.
• Kombinace s ortogonálními technikami (iontová mobilita, NMR) pro komplexní strukturní charakterizaci.

Závěr

Pracovní postup založený na Orbitrap Exploris 240 MS, Vanquish Horizon UHPLC, inteligentním AcquireX akvizičním workflow a Compound Discoverer softwaru poskytuje robustní, vysoce citlivé a efektivní řešení pro profilování a strukturální identifikaci metabolitů malých molekul. AcquireX workflow významně zvyšuje počet identifikovaných metabolitů oproti konvenční DDA, což vede k hlubší interpretaci biotransformací v komplexních biologických vzorcích.

Reference

• Zhu M., van Breemen R. B. Drug Metabolite Profiling and Identification by High-resolution Mass Spectrometry. Journal of Biological Chemistry. 2011; 286(29):25419–25425.
• Thermo Fisher Scientific. Smart Note: AcquireX Intelligent Data Acquisition Technology for Orbitrap Tribrid Mass Spectrometers. SN65392-EN. 2020.
• Thermo Fisher Scientific. White Paper: Compound Discoverer Software – Compounding Insights for Small Molecule Research. WP65210-EN. 2018.