Automated method optimization for drug-to-antibody ratio determination using hydrophobic interaction chromatography

Automatická optimalizace HIC metody pro stanovení poměru léčivo-protilátka (DAR)

Význam tématu

Antibody-drug conjugáty (ADCs) představují rychle rostoucí třídu biologických léčiv proti nádorovým onemocněním. Klíčovou kritickou vlastností těchto konjugátů je průměrný poměr cytotoxického léčiva na molekulu protilátky (DAR), který ovlivňuje účinnost, farmakokinetiku a toxicitu. Spolehlivé a reprodukovatelné stanovení DAR je proto pro vývoj a kontrolu kvality ADC zásadní.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem aplikace bylo demonstrovat automatizované a vědecky podložené optimalizační workflow (AQbD) pro stanovení DAR pomocí hydrofobní interakční chromatografie (HIC) na UHPLC systému. Pomocí softwaru Fusion QbD byly navrženy experimenty metodiky DoE, vyhodnocena data a definována operační oblast (MODR) pro robustní metodu s vysokým solným gradientem a organickým modifikátorem.

Použitá instrumentace

• UHPLC systém Thermo Scientific Vanquish Flex (Pump F, Split Sampler FT, Column Compartment H, biokompatibilní komponenty)
• Kolona Thermo Scientific MAbPac HIC-Butyl 4,6×100 mm, 5 μm
• Detektor UV/VIS (280 nm)
• Software Chromeleon 7.3.1 pro akvizici a Fusion QbD verze 9.9.2 pro DoE a modelování

Použitá metodika

Metoda využívá lineární gradient snižující koncentraci (NH4)2SO4 (1,5 M) v 50 mM fosfátovém pufru (pH 7,0) a 20 % isopropanolu v organické složce. DoE zahrnoval proměnné: teplota kolony (25–40 °C), doba gradientu (10–20 min), průtok (0,7–0,9 mL/min) a počáteční % organické fáze (0–20 %). Data z 30 běhů byla automaticky importována do Fusion QbD pro analýzu, modelování a výpočet MODR. Chromatogramy byly korigovány automatickou baseline subtraction z injekcí pouze eluentu.

Hlavní výsledky a diskuse

Optimalizované podmínky (teplota 25 °C, průtok 0,8 mL/min, gradient 18,5 min, počáteční 5 % B, 20 % IPA) splnily požadavky na rozlišení (R>1,5 pro DAR 8), špičatost i opakovatelnost. Predikované a experimentální retenční časy se lišily v průměru o ±0,22 min, rozdíl v relativních retenčních časech byl <6 s. Průměrné DAR hodnoty pro brentuximab vedotin (3,90), disitamab vedotin (3,91) a polatuzumab vedotin (3,43) korespondovaly s HRMS daty. Robustita metody byla potvrzena RSD retenčních časů <0,9 % a RSD ploch <2,0 % při opakovaných injekcích.

Přínosy a praktické využití metody

• Automatizace optimalizace šetří čas a minimalizuje chyby při manuálním nastavení DoE.
• Definice MODR zaručuje robustní metodu s flexibilními parametry provozu.
• Metoda je kompatibilní s biokompatibilním UHPLC prostředím a lze jí využít pro různé ADC s cysteinovým navázáním.
• Baseline subtraction zlepšuje čitelnost chromatogramu bez nutnosti čištění či výměny solí.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se širší adopce AQbD přístupu ve farmaceutické analytice v souladu s ICH Q14 a USP <1220>. Integrace s dvěma dimenzemi chromatografie a následnou HRMS analýzou umožní detailnější charakterizaci ADC a neizníkovaných vedlejších produktů. Digitální workflow a cloudová analytická řešení povedou k rychlejší validaci a výrobní kontrole nových konjugátů.

Závěr

Popsaná metoda demonstruje efektivní automatizovanou optimalizaci HIC pro stanovení DAR, která kombinuje robustní UHPLC systém, moderní software DoE a přehledné vyhodnocení MODR. Výsledná metoda nabízí reprodukovatelnost, flexibilitu a splňuje regulační požadavky.

Reference

1. Nguyen TD, Bordeau BM, Balthasar JP. Mechanisms of ADC toxicity and strategies to increase ADC tolerability. Cancers. 2023;15(3):713–747.
2. Baek J, Liu X. High-resolution separation of cysteine-linked antibody-drug conjugate mimics using hydrophobic interaction chromatography. Thermo Fisher Scientific Application Note 21079.
3. ICH Q14 Analytical Procedure Development, Draft version, 2022.
4. USP Chapter <1220> The Analytical Procedure Lifecycle, 2021.
5. Tome T, Žigart N, Časar Z et al. Development and optimization of LC methods by AQbD principles. Org Process Res Dev. 2019;23(9):1784–1802.
6. Cusumano A, Guillarme D, Beck A et al. Practical method development for mAb and ADC species in HIC. J Pharm Biomed Anal. 2016;121:161–173.
7. Younes A, Yasothan U, Kirkpatrick P. Brentuximab vedotin. Nat Rev Drug Discov. 2012;11(1):19–20.
8. Jiang J, Li S, Shan X et al. Preclinical safety profile of disitamab vedotin. Toxicol Lett. 2020;324:30–37.
9. Burke JM, Morschhauser F, Andorsky D et al. Antibody-drug conjugates for aggressive lymphomas: focus on polatuzumab vedotin. Expert Rev Clin Pharmacol. 2020;13(10):1073–1083.