Development of a systematic approach for improving tryptic digestion, recovery and chromatographic performance for mAb analysis

Význam tématu

Peptidové mapování monoklonálních protilátek je klíčové pro kontrolu primární struktury, post-translačních modifikací a kvality bioterapeutik. Standardní proteolytické trávení často trpí neúplným štěpením i variabilitou způsobenou manuálními kroky, zatímco chromatografie hydrofobních peptidů na C18 kolonech vykazuje špatný tvar píku a vysoké carry-over. Optimalizace těchto kroků zlepšuje spolehlivost kvantifikace a zkracuje dobu analýzy.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem studie bylo vyvinout automatizovaný postup trávení mAb trypsinem, který výrazně sníží počet neštěpených vazeb (missed cleavages), a optimalizovat chromatografické podmínky pro hydrofobní peptidy. Porovnány byly tři přístupy: dvoukrokový SMART Digest protokol, jednoetapový SMART Digest a konvenční in-solution MAM protokol.

Použitá metodika a instrumentace

• Digesce: Thermo Scientific KingFisher Duo Prime s SMART Digest kit – dvoukroková varianta (75 °C/15 min + 40 °C/30 min), jednoetapová varianta (75 °C/30 min) a klasický protokol s alkylací a výměnou pufru.
• Chromatografie: Vanquish Horizon UHPLC (binary pump, split sampler, column compartment), kolony Accucore 150-C4, Accucore C18, Hypersil GOLD C4 a C18 Selectivity.
• MS detekce: Orbitrap Fusion Tribrid s Ion MAX HESI-II zdrojem, DDA režim, EThcD a HCD fragmentace, rozlišení 120 000.

Hlavní výsledky a diskuse

• Počet peptidů bez missed cleavages: 60 % u dvoukrokového protokolu vs. 32 % u jednoetapového a 34 % u MAM protokolu.
• Chromatograficky C4 kolony zkrátily tailing hydrofobních peptidů a snížily sloupcové i mezivstřikovací carry-over oproti C18.
• U nového protokolu detekováno řazení raně eluovaných peptidů mezi 1,3–3 min, což vedlo ke změně divert-zavlažování z 3 min na 1,2 min.
• Přidání 8 M guanidinu HCl do mycích kroků SMART trávicích pryskyřic a do vzorku po digestii eliminovalo časově závislou ztrátu hydrofobních peptidů.

Přínosy a praktické využití metody

Automatizovaný dvoukrokový SMART Digest protokol poskytuje robustní, opakovatelnou přípravu vzorků s výrazně nižším výskytem chybějících štěpení, což usnadňuje kvantifikaci PTM. Použití C4 kolony zlepšuje tvar píku a minimalizuje carry-over, což je klíčové pro spolehlivost rutinního peptide mappingu.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Další rozvoj plně integrovaných automatizovaných workflow pro vysokou propustnost QC laboratoří.
• Optimalizace nových stacionárních fází pro selektivnější separaci peptidů s různou hydrofobicitou.
• Implementace pokročilých algoritmů pro real-time monitoring kvality dat během LC-MS/MS analýzy.
• Rozšíření metodiky na komplexnější bioterapeutika, např. bispecifické protilátky či glykoformy.

Závěr

Navržený dvoukrokový automatizovaný protokol SMART Digest v kombinaci s C4 koloniemi a optimalizovaným divertem výrazně redukuje missed cleavages, zlepšuje chromatografický výkon hydrofobních peptidů a zvyšuje celkovou spolehlivost peptide mappingu monoklonálních protilátek.

Reference

• Jakes C. et al. Tracking the Behavior of Monoclonal Antibody Product Quality Attributes Using a Multi-Attribute Method Workflow. J Am Soc Mass Spectrom. 2021;32:1998–2012.
• Kristensen D.B. et al. Optimized Multi-Attribute Method Workflow Addressing Missed Cleavages and Chromatographic Tailing/Carry-Over of Hydrophobic Peptides. J Anal Chem. 2022;94(49):17195–17204.