Seamless LC-MS method transfer in a biopharmaceutical development laboratory

Význam tématu

V biotechnologickém vývoji monoklonálních protilátek je klíčové získávat rychle spolehlivé informace o struktuře a kvalitativních vlastnostech molekul. Metoda SEC–MS v nativních podmínkách kombinuje separaci podle velikosti a hmotnostní spektrometrii s vysokým rozlišením, což umožňuje současné stanovení agregátů, proteoform i glykosylace bez potřeby samostatné přípravy vzorků.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo bezproblémově přenést osvědčenou metodu velikostní-exclusion chromatografie s nativní hmotnostní spektrometrií (SEC–MS) z platformy Thermo Scientific Q Exactive Plus na novou generaci Orbitrap Exploris 480. Hlavním požadavkem bylo zachovat konzistenci dat, robustnost měření a vysokou reprodukovatelnost při analýze stovek kandidátních protilátek v rámci výběrových studií.

Použitá metodika a instrumentace

Pro chromatografii byla použita sestava Vanquish Horizon Duo UHPLC s tandemovým SEC uspořádáním, které zajišťuje plnou využitelnost času MS akvizice (analytický cyklus 4,7 minuty). Mobilní fáze obsahovala 25 mM acetát amonný pH 5,4, průtok 0,3 mL/min a teplotu kolony 20 °C. Jako detekce MS byly porovnány dvě platformy:

• Q Exactive Plus s BioPharma Option (rozlišení 35 000 @ m/z 200, m/z rozsah 2 500–8 000)
• Orbitrap Exploris 480 s BioPharma Option (optimalizované rozlišení 45 000 @ m/z 200, režim Intact Protein)

Datové zpracování probíhalo v Chromeleon CDS, pro dekonvoluci proteoform byla využita platforma Protein Metrics Byos.

Hlavní výsledky a diskuse

• Optimalizace rozlišení: Pro rozlišení blízkých glykoforem (G0F/Man5 vs. G0F/G0F-GlcNAc) bylo nutné použít rozlišení ≥45 000; nižší hodnoty (<30 000) vedly k překryvu isotopických distribucí.
• Spotřeba vzorku: Při injekci 1–10 µg protilátky byly rozdíly v relativním zastoupení glykoforem minimální, což umožňuje snížit požadovanou koncentraci.
• Přenos metody: Porovnání dat z obou MS platforem pro kontrolní protilátku ukázalo shodu distribuce glykosylovaných forem ( rozdíly v rel. intenzitách <1 %).
• Robustnost a reprodukovatelnost: Vzorky analyzované různými techniky během 6–7 měsíců vykazovaly nízké %CV a konzistentní výsledky pro di- a mono-glykosylované formy.

Přínosy a praktické využití metody

• Zvýšení propustnosti pracoviště (<5 min na vzorek) bez kompromisů na kvalitě dat.
• Snížení spotřeby vzorku díky vyšší citlivosti Exploris 480 (typicky 4 µg místo 10 µg).
• Jednotná operační a zpracovatelská rutina (Chromeleon CDS, Byos) minimalizuje chyby a ulehčuje validaci.
• Zajištěný přenos technologie mezi platformami se zachováním parametrů robustnosti a přesnosti.

Budoucí trendy a možnosti využití

Další rozvoj nativní SEC–MS může směřovat k plné automatizaci výběrových studií, integraci procesního monitoringu v reálném čase a využití strojového učení pro predikci proteoform. Kombinace nativních a denaturačních režimů v jednom workflow dále rozšíří informace o modifikacích a interakcích komplexních proteinových látek.

Závěr

Seamless transfer SEC–MS metody mezi Q Exactive Plus a Orbitrap Exploris 480 umožnil zvýšit rozlišení a citlivost, snížit spotřebu vzorku a zachovat plnou konzistenci dat při analýze stovek protilátek. Nová platforma představuje výkonné, robustní a uživatelsky přívětivé řešení pro vývoj biofarmak.

Reference

1. Thermo Scientific Customer Application Note 73423. Increasing throughput of native SEC-MS in biopharmaceutical development using a tandem UHPLC setup.
2. Thermo Scientific Application Note 73885. Complete characterization of monoclonal antibodies under native and denaturing conditions.
3. Thermo Scientific Application Note 72348. Full characterization of heterogeneous antibody samples under denaturing and native conditions on the Q Exactive BioPharma mass spectrometer.