Accurate and precise quantification of mAb-released N-glycans with an amide HILIC column

Význam tématu

Glykanová analýza monoklonálních protilátek (mAb) představuje klíčový krok v charakterizaci bioterapeutik. Glykosylace ovlivňuje bezpečnost, účinnost, clearance i imunogenicitu proteinu, a proto je nutné monitorovat kvalitu N-glykanů během celého výrobního procesu. Robustní, reprodukovatelné a přesné metody kvantifikace jsou nezbytné pro splnění regulačních požadavků a udržení vysoké kvality biopotravin.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo demonstrovat robustnost, reprodukovatelnost, přesnost a preciznost kvantifikace N-glykanů u lidské IgG pomocí systému Thermo Scientific Vanquish Horizon UHPLC v kombinaci s kolonkou Accucore 150 Amide HILIC. Studie zahrnovala testy intra- a inter-lot reproducibility, odolnosti kolony při dlouhodobém provozu a korelaci s validovanou výrobní metodou.

Použitá instrumentace

• UHPLC systém: Vanquish Horizon (System Base, Binary Pump H, Column Compartment H, Split Sampler HT, Fluorescence Detector F)
• Kolonka: Thermo Scientific Accucore 150 Amide HILIC, 2.1 × 150 mm, 2.6 µm
• Detekce: Fluorescenční detektor (Ex 320/Em 420 nm pro 2-AB, Ex 455/Em 500 nm pro APTS)
• Software: Thermo Scientific Chromeleon CDS 7.2.5
• Chemikálie: Optima acetonitril, 100 mM ammonium formátu (pH 4,4), deionizovaná voda
• Standardy: 2-AB a APTS značené N-glykany fetuinu, maltotriose, lidské IgG a NIST mAb

Metodika

Vzorky se připravily procesem denaturace, enzymatické deglykosylace a značení fluorescenčními barvivy 2-AB nebo APTS, následným odstraňováním přebytečné matrice. Separace probíhala gradientní HILIC chromatografií (70→40→70 % acetonitrilu) při 0,45 mL/min, teplotě kolony 50 °C a injekčním objemu 1–10 µL. Kvantifikace vycházela z relativní plochy píků.

Hlavní výsledky a diskuse

• Intra- a inter-lot reproducibility: retenční časy RSD < 2 %, asymetrie < 6,5 %, účinnost < 3 %; zpětný tlak ~170 bar s RSD < 3 %; lot-to-lot RSD < 7 %.
• Životnost kolony: 500 kontinuálních běhů APTS-značených N-glykanů; retenční časy hlavních složek RSD < 0,5 %, rozlišení izomerů G1Fa/G1Fb USP 2,07–2,26 (RSD 2,76 %), relativní plocha RSD < 1 % až 3 %.
• Kvantifikace 13 2-AB značených N-glykanů lidské IgG: separace do 22 minut při tlaku < 200 bar, šířka píků < 7 s, relativní plocha RSD < 4 %. Demingova regrese ukázala sklon 1,017 a R² = 0,9987, průměrná odchylka bias ± 3 % oproti referenčním datům.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda nabízí vysokou spolehlivost a opakovatelnost v rutinním provozu QA/QC laboratoří biotechnologického průmyslu. Díky nízkým provozním tlakům a rychlé separaci umožňuje efektivní kontrolu glykoprofilu mAb v rámci Quality by Design a validačních studií.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se širší integrace s hmotnostní spektrometrií pro struktturní charakterizaci glykanů, vyšší automatizace přípravy vzorků, miniaturizace a zrychlení analýzy. Další rozvoj v oblasti fluorescenčních značení a nových stacionárních fází podpoří komplexní glykoanalýzy.

Závěr

Kombinace Vanquish Horizon UHPLC a kolony Accucore 150 Amide HILIC poskytuje robustní, přesnou a vysoce reprodukovatelnou platformu pro kvantifikaci a charakterizaci mAb-uvolněných N-glykanů. Výsledky potvrzují vhodnost metody pro regulační dokumentaci a průmyslové nasazení.

Reference

• Walsh G. Nature Biotech. 2010, 28(9), 917–924.
• Fournier J. BioPharm. International. 2015, 28(10), 32–37.
• Sanda M. et al. Mol. Cell. Proteomics 2013, 12, 1294–1305.
• Grünwald-Gruber C. et al. Anal. Bioanal. Chem. 2017, 409(10), 2519–2530.
• Ahn J. et al. J. Chromatogr. B. 2010, 878(3-4), 403–408.
• Certificate of Analysis for 2AB Labeled IgG N-Glycan Library, Ludger.