The Use of Hydrophilic Interaction Chromatography with Mass Spectrometry Detection for the Separation of Basic Pharmaceuticals and Food Toxins

Význam tématu

Metody kapalné chromatografie založené na reversní fázi (RPLC) mají omezenou schopnost retence silně polárních či ionizovatelných sloučenin, což komplikuje analýzu některých léčiv a potravinových toxinů. Hydrofobní interakce nestačí k oddělení velmi polárních látek, a úpravy RPLC často vedou k problémům s fázovým kolapsem, nízkou citlivostí v MS detekci či pomalou rovnovážností. Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography (HILIC) představuje alternativu, která využívá polární stacionární fáze a vysoce organické mobilní fáze, čímž zajišťuje lepší retenci a citlivost pro polární sloučeniny. HILIC tak umožňuje efektivní analýzu základních farmaceutik (paroxetin, ranitidin) a toxinů v potravinách (melamin, kyanurická kyselina).

Cíle a přehled studie / článku

Článek představuje přehled principů HILIC, porovnává ji s RPLC a nabízí příklady aplikací používajících LC-MS/MS pro kvantitativní stanovení farmaceutik v biologických vzorcích a toxinů v potravinovém matrixu. Hlavní cíle zahrnují optimální volbu fází a mobilních fází, nastavení podmínek pro dosažení vysoké citlivosti, lineárního rozsahu a minimálních detekčních limitů.

Použitá metodika a instrumentace

V experimentech byly porovnávány dva režimy:

• RPLC s kolonou ZORBAX Eclipse XDB-C18 (2,1×150 mm, 5 μm), gradient 5→90 % acetonitrilu (10 min), eluenty 8 mM formiátu amonného.
• HILIC s kolonou ZORBAX RX-SIL (2,1×150 mm, 5 μm), gradient 100→50 % acetonitrilu (10 min), eluenty 8 mM formiátu amonného.

MS detekce: ESI pozitivní ionizace, Agilent Series 1100 LC/MSD Trap nebo Agilent 6410 Triple Quadrupole, módy SIM a MRM, optimalizované fragmentorové napětí a kolizní energie.
Pro analýzu melaminu a kyanurické kyseliny v matricích potravin bylo použito RRLC Agilent 1200 s isokratickou fází (95 % acetonitrilu/5 mM acetátu amonného) a MRM segmentace pro oddělení pozitivní a negativní ionizace.

Hlavní výsledky a diskuse

HILIC režim poskytl výrazně lepší retenci a ostré symetrické píky pro paroxetin i ranitidin ve srovnání s RPLC. Citlivost v ESI-MS se zvýšila až trojnásobně, detekční limity dosáhly sub-ppb úrovní (0,5 ppb) s vynikajícím poměrem S/N. Linearita kalibrace byla v rozsahu 0,5–100 ppb s r2 > 0,999. Testy extrakcí z lidské séra ukázaly obnovy 79–98 %. U matrice suchého krmiva i obilných proteinů byla ukázána spolehlivá analýza melaminu a kyanurické kyseliny s detekčními limity kolem 50 ppt.
Optimalizace parametrů (podíl organiky, koncentrace soli, objem injekce, typ kolony) prokázala kritický vliv na retenční dobu a účinnost separace. Zvýšení obsahu acetonitrilu posunulo retenční časy a změna koncentrace acetátu amonného upravila iontovou sílu a tvar píku.

Přínosy a praktické využití metody

• Vysoká retence a rozlišení polárních a ionizovatelných látek, které jinak vyplouvají v předním „solventním“ proudu.
• Výrazné zvýšení citlivosti v LC-MS/MS díky lepší desolvataci a tvorbě kapek v ESI.
• Možnost přímé injekce proteinových precipitátů nebo eluátů z SPE bez dodatečné úpravy.
• Možnost kombinace dvou dimenzí (2D chromatografie) s orthogonálními separačními principy RPLC a HILIC pro komplexní proteomické či metabolomické analýzy.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se další rozvoj specializovaných HILIC fází (zwitteriontní, mixed-mode), širší využití v 2D LC separacích a integrace s high-resolution MS. Rostoucí publikační aktivita a nové komerční kolony potvrzují zájem o tuto techniku. Potenciál HILIC leží také v aplikacích na farmaceutickou kontrolu kvality, environmentální analýzy a potravinovou bezpečnost, kde je potřeba detekovat extrémně polární kontaminanty.

Závěr

HILIC s MS detekcí efektivně řeší omezení RPLC pro polární sloučeniny. Umožňuje vyšší retenci, lepší tvar píku i citlivost, přičemž poskytuje spolehlivé výsledky ve farmaceutických a potravinových aplikacích. Metoda je flexibilní, rychle se vyrovnává s různými matricemi a představuje perspektivní alternativu pro analytickou chemii.

Reference

• Majors R.E., LCGC Survey, 2007.
• Pittcon 2008 Report, LCGC North America, March 2008.
• Majors R.E., LCGC No. Amer. Column Survey, 2007.
• FDA, GC-MS Screen for the Presence of Melamine, Ammeline, Ammelide & Cyanuric Acid, Version 2, May 7, 2007.