Media Component Analysis during Human Primary T Cell Culture using a Triple Quadrupole Mass Spectrometer

Význam tématu

Analýza složení kultivačního média v reálném čase je klíčová pro optimalizaci produkční kvality a účinnosti CAR T buněčné terapie. Díky rychlému a citlivému stanovení spotřebovaných a vylučovaných metabolitů lze sledovat metabolický stav buněk, předcházet vyčerpání živin a maximalizovat výtěžnost buněk.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo vyvinout 17minutovou LC-MS/MS MRM metodu schopnou současně kvantifikovat 144 sloučenin souvisejících s růstem buněk v médiu T lymfocytů. Metoda byla aplikována na dva experimentální vzorky kultivace primárních lidských T buněk: jednu bez výměny média (flask A) a druhou s výměnou média ve dnech 3, 5 a 7 (flask B).

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky média byly připraveny proteinovou precipitací acetonitrilem, centrifugací a následným naředěním. Separace probíhala na obráceně fázové kolóně Shimadzu Cell Culture Profiling (150×2,1 mm, 3 µm) s gradientem vody a acetonitrilu s 0,1 % kyseliny mravenčí. Detekce byla realizována na Shimadzu LCMS-8060 triple quadrupole hmotovém spektrometru v režimu ESI+ a ESI– s rychlým přepínáním polarity v režimu MRM.

Hlavní výsledky a diskuse

Flask B s mediální výměnou dosáhl přibližně trojnásobného počtu živých buněk oproti flask A. Volkanový graf identifikoval klíčové metabolity s významnými změnami koncentrací:

• Glutamin – výrazný pokles v průběhu kultivace
• O-fosfoetanolamin – akumulace spojená se s downregulací enzymu PCYT2
• Sérin a glycin – dynamika konverze podpořená aktivací T buněk
• Glukóza – postupný úbytek a zvýšená produkce laktátu, indikující posun k anaerobní glykolýze

Časové průběhy koncentrací umožnily naznačit metabolické dráhy a potenciální mechanismy spotřeby živin během expanze T buněk.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda umožňuje:

• Rychlé a komplexní sledování více metabolitů současně
• Včasnou detekci nutričního stresu buněk
• Optimalizaci strategií výměny média a doplňování živin
• Implementaci do procesů QA/QC v produkci buněčných terapií

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekávané směry dalšího rozvoje:

• Online monitoring kultivace s automatickou regulací parametrů média
• Rozšíření panelu sledovaných metabolitů a lipidů
• Integrace s multivariačními analýzami a strojovým učením pro prediktivní modely
• Aplikace v dalších typech buněčných terapií a bioprocesů

Závěr

Vyvinutá 17minutová LC-MS/MS metoda pro 144 sloučenin poskytuje citlivý a rychlý nástroj pro sledování metabolických změn v kulturách T buněk. Umožňuje optimalizovat strategii výměny média, zvyšovat výtěžnost a kvalitu CAR T buněčných přípravků.

Reference

• Osawa T., et al. Phosphoethanolamine accumulation protects cancer cells under glutamine starvation through downregulation of PCYT2. Cell Reports 29(1):89–103, 2019.
• Ma E.H., et al. Serine is an essential metabolite for effector T cell expansion. Cell Metabolism 25(2):345–357, 2017.
• Palmer C.S., et al. Glucose metabolism regulates T cell activation, differentiation, and functions. Frontiers in Immunology 6:1, 2015.