Simultaneous analysis of supernatant components of cell culture using triple quadrupole LC/MS/MS

Význam tématu

Monitorování složení kultivačního média je klíčové pro optimalizaci bioprocesů včetně výroby biopaliv či biotechnologických léčiv. Komplexní profilování aminokyselin, cukrů, nukleotidů, vitaminů a dalších metabolitů poskytuje hlubší vhled do metabolismu buněk a umožňuje lepší řízení fermentačního procesu.

Cíle a přehled studie

Cílem práce bylo vyvinout a ověřit jednotnou metodu pro simultánní analýzu 95 složek supernatantu bakteriálních i streptomycetových kultur. Studii představuje balíček metod umožňující rychlé a citlivé stanovení širokého spektra látek během kultivace.

Použitá metodika a instrumentace

Přetížení bílkovin a extrakce matrice proběhla precipitací acetonitrilem za přítomnosti interního standardu. Analýzu zajišťuje UHPLC systém Nexera MP spojený s trojitým kvadrupólem LCMS-8050. Ionizace probíhá v ESI režimu s ultrarychlým přepínáním polarity, data jsou sbírána v režimu MRM s rychlostí až 555 přechodů za sekundu. Chromatografie trvá 17 minut včetně ekvilibrace kolony.

Hlavní výsledky a diskuse

Optimalizované podmínky vedly k dostatečné citlivosti pro vysoce koncentrované i stopové analyty. Ukázalo se, že metodiku lze aplikovat na sledování dynamiky metabolitů během kultivace:

• U bakterií klesá koncentrace sukcinové kyseliny, roste 2-aminoethanol, deoxycytidin se zvyšuje do 10 h a poté klesá, biotin zůstává stabilní.
• U Streptomyces se alanin výrazně snižuje do 72 h, citrullin klesá do 72 h a pak roste, cytidin vrcholí kolem 86 h a následně klesá, gluconová kyselina kontinuálně stoupá.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda umožňuje rychlé a komplexní sledování metabolického stavu kultur, což je přínosem pro procesní kontrolu v bioreaktorech, vývoj nových produktů a optimalizaci výtěžnosti bioprodukten. Jednoanalytická dávka trvá méně než 20 minut, což výrazně zrychluje workflow v kontrolních laboratořích.

Budoucí trendy a možnosti využití

S pokračujícím rozvojem hromadných metod pro metabolomiku lze očekávat rozšíření balíčků o další skupiny látek, jako jsou lipidy či signální molekuly. Integrace s on-line odběrem vzorků a automatizovanými přístroji otevře dveře pro nepřetržitý monitoring fermentací ve výrobním měřítku.

Závěr

Navržený metodický balíček pro analýzu supernatantů buněčných kultur dokáže ve 17minutovém cyklu citlivě a simultánně stanovit více než 90 metabolitů. Takto získaná data přispívají k lepšímu řízení bioprocesů a efektivnějšímu vývoji biotechnologií.

Reference

• Liu Q, Hao H, Song Y, Li Q, Liu Z, Huang T, Hashi Y. Simultaneous analysis of supernatant components of cell culture using triple quadrupole LC/MS/MS. ASMS 2016; Shimadzu Corporation.