Quantitative Analysis of Polar Metabolites with Comprehensive Plasma and Cell Targeted Metabolomics Workflow

Význam tématu

Metabolomika se stále více uplatňuje v biomedicínském i průmyslovém výzkumu díky schopnosti kvantifikovat široké spektrum malých polaritních metabolitů. Cílené metody s izotopově značenými standardy přinášejí vysokou citlivost, přesnost a reprodukovatelnost, což usnadňuje sledování metabolických drah, biomarkerů i farmakokinetiky.

Cíle a přehled studie

Studie představuje aktualizaci solidního cíleného workflow pro polaritní metabolity s využitím čtvrté generace LC/TQ (6495) a široké databáze ~500 sloučenin. Cílem bylo ukázat integraci izotopově značených standardů (13C) pro absolutní kvantifikaci metabolitů v buňkách a plasmatu, optimalizovat iontový trychtýř a potvrdit výkonnost při rychlých metodách s nízkými doletovými časy.

Použitá instrumentace

• Agilent 1290 Infinity II Bio LC se stacionární fází HILIC-Z (2,1 × 150 mm)
• Agilent 6495 4th Generation LC/TQ s novým iontovým trychtýřem
• MassHunter Acquisition 12 Optimizer pro automatickou optimalizaci MRM přechodů
• Agilent Bravo Sample Prep Platform pro automatizovanou extrakci ze vzorků

Použitá metodika

Využívá se workflow založené na HILIC separaci pro polaritní metabolity, kde jsou vzorky buněčných kultur (K562) a myší plasmy automatizovaně extrahovány pomocí EMR-Lipid SPE. Kalibrace se provádí mixem standardů a 13C yeast extract (CIL) v matici 70 % ACN/20 % vody/10 % MeOH. Analýza probíhá v režimu rychlého polaritního přepínání s doletovým časem 5 ms, přičemž MassHunter 12 Optimalizer umožňuje automatický výběr kvantifikačních i kvalifikačních iontů a nastavení kolizního napětí.

Hlavní výsledky a diskuse

• Detekční limity (LOD) v rozmezí femtomolů a kvantifikační limity až od 0,1 nM se 6 řády lineárního rozsahu a R2 > 0,99.
• Relativní směrodatné odchylky (RSD) < 10 % na úrovni standardů i v komplexní matici buněk a plasmy.
• Nové volby iontového trychtýře (Fragile, Standard) umožňují zvýšit signál u citlivých analyzátů až o 28 %.
• I při extrémně rychlém režimu (0,5 ms doletu) zůstává měření stabilní s RSD < 2 %.

Přínosy a praktické využití metody

Implementované řešení poskytuje kompletní end-to-end workflow od automatizované extrakce, přes stabilní HILIC chromatografii až po kvantifikaci s izotopově značenými standardy. Metoda je vhodná pro vysokopropustný screening metabolomů, farmakometabolomiku, QA/QC v bioprodukci i výzkum metabolických poruch.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se další rozšíření databází izotopově značených metabolitů, zlepšení softwarových nástrojů pro rychlou optimalizaci přechodů a integrace s datově orientovanými přístupy strojového učení. Miniaturizace přípravy vzorků a aplikace na single-cell metabolomiku otevírají nové směry ve studiu heterogenity buněk.

Závěr

Studie demonstruje, že 4. generace LC/TQ spolu s automatizovanou přípravou vzorků a HILIC separací umožňuje citlivou, přesnou a reprodukovatelnou kvantifikaci stovek polaritních metabolitů v komplexních maticích, což zjednodušuje přechod od objevování metabolických drah k rutinnímu absolutnímu kvantifikování.

Reference

• Yannell KE, Durham SD, Simmermaker C, Van de Bittner GC. An End-to-End Targeted Metabolomics Workflow. Agilent Application Note 5994-5628EN; 2023.
• Van de Bittner GC, et al. An Automated Dual Metabolite + Lipid Sample Preparation Workflow for Mammalian Cell Samples. Agilent Application Note 5994-5065EN; 2022.
• Sartain M, et al. Enabling Automated, Low-Volume Plasma Metabolite Extraction with the Agilent Bravo Platform. Agilent Application Note 5994-2156EN; 2020.
• Yannell KE, et al. Mastering HILIC-Z Separation for Polar Analytes. Agilent Application Note 5994-5949EN; 2023.