LC-MS/MS Analysis of Urinary Benzodiazepines and Z-drugs via a Simplified, Mixed-Mode Sample Preparation Strategy

Význam tématu

Benzodiazepiny a Z-léky jsou klíčové psychoaktivní látky používané v klinické praxi i forenzní toxikologii. Vzhledem k nárůstu předávkování je rychlá a přesná analýza v moči nezbytná pro diagnostiku, monitorování léčby a vyšetřování trestných činů.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo vyvinout rychlý a zjednodušený postup extrakce a LC-MS/MS analýzy panelu benzodiazepinů, jejich metabolitů a Z-léků z moči. Hlavními kroky byly enzymatická hydrolýza a pevná fáze extrakce v jednotné destičce, eliminace některých kroků a optimalizace chromatografie a hmotové spektrometrie.

Použitá metodika

Popis hlavních kroků:

• Enzymatická hydrolýza β-glukuronidázou přímo v jamce Oasis MCX µElution destičky při 50 °C po 1 h.
• Okyselení vzorku 4 % kyselinou fosforečnou a přímé nasátí na sorbent bez kondicionace a ekvilibrace.
• Dvousložkové promývání: 0.02 N HCl a 20 % metanol.
• Eluce 60:40 acetonitril:metanol s 5 % amoniaku a následné naředění ve vzorkovém ředidle.

Použitá instrumentace

• LC systém ACQUITY UPLC I-Class
• Kolona CORTECS UPLC C18+ 1.6 µm 2.1×100 mm
• Hmotový spektrometr Xevo TQ-S micro v režimu ESI+
• SPE destičky Oasis MCX µElution Plate
• Software MassLynx s TargetLynx Application Manager

Hlavní výsledky a diskuse

Výkonnost metody:

• Průměrný výtěžek extrakce 91 % (rozmezí 76 až 102 %), průměrný CV 8.6 %.
• Snížení matričních efektů na 17.7 % oproti 25.3 % při použití reverzní fáze.
• Detekční a kvantifikační limity 0.5 ng/ml, rozsah kalibrace 0.5–500 ng/ml s R2 ≥ 0.997.
• QC vzorky s přesností do ±10 % a opakovatelností CV ≤ 9 % v rámci i mezi šaržemi.
• Chromatografická baseline separace všech klíčových párů analytů včetně izobarických standardů díky C18+ technologii.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda nabízí významné zjednodušení workflow a úsporu času i rozpouštědel. Všechny kroky probíhají v jedné destičce, čímž se minimalizují přenosy vzorků a riziko kontaminace. Vysoká citlivost, přesnost i reprodukovatelnost odpovídají požadavkům klinické a forenzní analýzy.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Adaptace na HPLC systémy při zachování separační účinnosti.
• Automatizace a škálování pro vysokopropustnou high-throughput analýzu.
• Aplikace podobné strategie na jiné skupiny farmak aktivních v biologických matricích.
• Integrace miniaturizovaných testů a kombinačních modulů pro komplexní toxikologické panely.

Závěr

Zjednodušený postup SPE s Oasis MCX µElution destičkami a optimalizovaná LC-MS/MS analýza poskytují rychlou, přesnou a reprodukovatelnou metodu pro stanovení benzodiazepinů a Z-léků v moči. Díky eliminaci kondicionačních kroků a integraci hydrolýzy v jedné jamce je workflow výrazně efektivnější oproti tradičním metodám.

Reference

• Jufer-Phipps R Levine B Benzodiazepiny v Principles of Forensic Toxicology AACC Press 2013 str 237–270
• Karihanom M Number of Deaths from Prescription Drugs National Institute of Drug Abuse 2015
• Laloup M et al Validation of LC-MS/MS for Benzodiazepines J Anal Toxicol 2005 29(7) 616–626
• Marin SJ et al Quantitation of Benzodiazepines in Biological Matrices by LC-MS-MS J Anal Toxicol 2008 32(7) 491–498
• Marin SJ et al Sensitive UPLC-MS/MS Assay for 21 Benzodiazepines J Anal Toxicol 2012 36(7) 472–476