Automated High-Throughput N-Glycan Labelling and LC-MS Analysis for Protein A Purified Monoclonal Antibodies

Význam tématu

N-glykosylace terapeutických monoklonálních protilátek výrazně ovlivňuje jejich farmakokinetiku, imunitní odpověď a efektorové funkce. Monitoring této posttranslační úpravy je proto nezbytný jako kritický kvalitativní atribut během vývoje, výroby a kontroly bioterapeutik, včetně biosimilars.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo rozšířit dosavadní GlycoWorks RapiFluor-MS workflow automatizované přípravy a analýzy N-glykanů o krok diafiltrace, který umožní práci s protein A-purifikovanými protilátkovými vzorky v libovolných pufrech a koncentracích. Klíčovým krokem je zajištění reprodukovatelného profilu glykosidů pro vysokou propustnost (48 vzorků) v krátkém čase.

Použitá metodika

• Automatizovaná diafiltrace na 96dobré destičce MWCO 10 kDa (Pall AcroPrep Advance Omega) za pomoci robotu Andrew+ s modulem Extraction+.
• Denaturace protilátky, PNGase F enzymatická hydrolýza glykosidických vazeb a následné značení RapiFluor-MS barvivem v DMSO prostředí.
• Očištění značených N-glykanů pomocí HILIC-SPE destiček.
• Rychlá chromatografie glykanů během pěti minut na kolonce ACQUITY UPLC Glycan BEH Amide a detekce LC-MS systémem BioAccord se softwarovým workflow Accurate Mass Screening.

Použitá instrumentace

• Robot Andrew+ s příslušenstvím Vacuum+ a Extraction+ pro diafiltraci a manipulaci se vzorky.
• ACQUITY UPLC I-Class PLUS včetně teplotně řízené autosamplovací jednotky a kolony Glycan BEH Amide (1,7 µm, 2,1×150 mm).
• BioAccord LC-MS System se zdrojem ESI+, detektorem ACQUITY RDa a software waters_connect pro řízení instrumentace a zpracování dat.

Hlavní výsledky a diskuse

• Automatizovaný diafiltrační protokol poskytl porovnatelné glykanové profily s manuálním standardním postupem, přičemž celkový výtěžek dosahoval v průměru 73 %.
• Relativní a absolutní zastoupení hlavních glykosidů (FA2, FA2G1, FA2G2) vykazovalo %RSD pod 15 % napříč 48 vzorky.
• Systém umožnil odhalit i nízkomnožstevní glykosidové varianty (např. M5, FA2G2S1, FA2BG1) a prokázal rozdíl ve vysokomannózových formách mezi vzorky purifikovanými z PBS a buněčného média.

Přínosy a praktické využití

• Kompletní workflow pro vysokopropustné hodnocení CQA glykanové heterogenity u Protein A-purifikovaných mAb.
• Schopnost zpracovat 48 vzorků do 3 h přípravy a následně analyzovat všechny vzorky LC-MS během 4 h.
• Flexibilita pufrů a koncentrací eliminuje potřebu manuálního buffer exchange a zkracuje časový sled vývoje a kontroly kvality.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace další automatiky a on-line datové analýzy pro okamžitý reporting CQA parametrů glykanového profilu.
• Adaptace protokolu pro jiné glykoproteiny a testování nových značených reagentů s vyšší citlivostí pro nízkoabundantní formy.
• Propojení s bioreaktorovými systémy pro in-process monitoring a rychlou optimalizaci výrobních procesů.

Závěr

Automatizovaný diafiltrační GlycoWorks RapiFluor-MS protokol umožňuje robustní a rychlou analýzu N-glykanů z Protein A-purifikovaných mAb v jakémkoli pufru a koncentraci. Kombinace s pěti­minutovým LC-MS cyklem zajišťuje vysokou propustnost, reprodukovatelnost a detailní glykanové profily pro kritické i stopové glykosidové formy.

Reference

• Zhang P. et al. Drug Discovery Today. 2016, 21(5):740–765.
• Reusch D., Tejada M.L. Glycobiology. 2015, 25(12):1325–1334.
• Duivelshof B.L. et al. Analytica Chimica Acta. 2019, 1089:1–18.
• Zhang X. et al. SLAS Technology. 2020, 24(4):380–387.
• Lauber M.A. et al. Analytical Chemistry. 2015, 87(10):5401–5409.