The determination of carbohydrates, alcohols, and glycols in fermentation broths

Význam tématu

Analýza složek fermentačních kalů je klíčová pro biotechnologické procesy od produkce bioterapeutik až po výrobu biopaliv. Karbonové zdroje jako sacharidy podporují růst mikroorganismů a syntézu cílových produktů, zatímco vedlejší produkty (alkoholy, glykoly, organické anionty) mohou výtěžek snižovat. Přesné stanovení jednotlivých složek pomáhá optimalizovat podmínky fermentace a zvyšovat efektivitu procesu.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo ověřit vhodnost vysokovýkonné aniontové výměnné chromatografie s pulzní amperometrickou detekcí (HPAE-PAD) pro současné stanovení jednoduchých cukrů, cukerných alkoholů, alifatických alkoholů a glykolů ve složitých matricích fermentačních médií Saccharomyces cerevisiae (YPD) a Escherichia coli (LB). Porovnaly se dvě kolonové konfigurace (Dionex CarboPac MA1 a PA1) z hlediska selektivity, detekčních limitů, linearity, přesnosti a stability metod.

Použitá metodika a instrumentace

Chromatografie probíhala na systému Thermo Scientific Dionex DX-500 BioLC vybaveném:

• Gradientní pumpa GP40 s možností odplynění
• Elektrochemický detektor ED40 pro pulzní amperometrii
• Chromatografická pece LC30/LC25
• Autosampler S3500
• Softwarové zpracování v PeakNet Workstation

Kolony:

• Dionex CarboPac MA1 Analytical + MA1 Guard (polymerní makroporézní pryskyřice s kvaternárními amoniovými skupinami)
• Dionex CarboPac PA1 Analytical + PA1 Guard (pelikulární latexová náplň s aniontovými výměnnými místy)

Eluce probíhala isokraticky nebo gradientně s hydroxidem sodným (16–480 mM), objem vzorku 10 µL, teplota 30 °C. Vzorky fermentačního média se před analýzou odstředily a zředily deionizovanou vodou.

Hlavní výsledky a diskuse

Selektivita kolon CarboPac MA1 a PA1 se liší především v pořadí eluce a rozlišení velkých sacharidů. MA1 odděluje alkoholické a cukerné sloučeniny včetně trisacharidů, ale analýza trvá až 60 min. PA1 dovoluje zkrácenou analýzu (<30 min) s dobrou separací mono- a disacharidů podél optimalizované koncentrace hydroxidu.

Detekční limity na MA1 dosahují řádově 0,2 ng pro alditoly, 0,4 ng pro glycerol či 1 ng pro cukry. Linearita je pro většinu analytů v rozsahu 0,04 až 200 mg/L (3–4 dekády), včetně dvouřádkových poly­nomiálních korelací u glycerolu a erytritolu. Přesnost (RSD oblasti vrcholu) do 3 % a stabilita retencí do 0,3 % za 48 h potvrzují vysokou reprodukovatelnost metody.

Praktické sledování fermentace prokázalo schopnost metody kvantifikovat pokles glukózy a rafinózy během 1 h, nárůst glycerolu a změny dalších metabolitů v kultuře kvasinek i bakterií, což umožňuje detailní kinetickou kontrolu.

Přínosy a praktické využití metody

• Simultánní stanovení širokého spektra sacharidů, alditolů, alkoholů a glykolů bez derivatizace
• Vysoká citlivost a selektivita pulzní amperometrie pro nechromoforické látky
• Široký dynamický rozsah s omezenou nutností opakování analýz při variabilních koncentracích
• Možnost on-line monitorování fermentačního procesu a optimalizace živinového podání
• Vhodné pro QA/QC v biotechnologiích, potravinářství i výrobě biopaliv

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace on-line odběru vzorků a automatizovaná regulace podmínek fermentace
• Nasazení nových vlnových forem a elektrod pro zvýšení citlivosti a selektivity
• Kombinace HPAE-PAD s hmotnostní spektrometrií pro identifikaci neznámých metabolitů
• Vývoj užších a rychlejších kolon s menšími objemy plnící hmoty
• Implementace metodiky v průmyslových výrobních linkách pro kontinuální kontrolu kvality

Závěr

HPAE-PAD na kolonách CarboPac MA1 a PA1 poskytuje robustní a vysoce selektivní platformu pro kvantitativní stanovení fermentačních složek. Metoda nabízí dostatečnou citlivost, široký dynamický rozsah a reprodukovatelnost nezbytnou pro výzkum i průmyslovou praxi.

Reference

• Robinett R.S.R.; Herber W.K. J. Chromatogr. A. 1994, 671, 315–322.
• Herber W.K.; Robinett R.S.R. J. Chromatogr. A. 1994, 676, 287–295.
• Marko-Varga G. et al. J. Chromatogr. A. 1994, 665, 317–332.
• Schugerl K. et al. Anal. Chim. Acta. 1993, 279, 3–16.
• Rank M.; Gram J.; Danielsson B. Anal. Chim. Acta. 1993, 281, 521–526.
• Buttler T.; Gorton L.; Marko-Varga G. Anal. Chim. Acta. 1993, 279, 27–37.
• van de Merbel N.C. et al. Anal. Chim. Acta. 1993, 279, 39–50.
• van de Merbel N.C. et al. Chromatographia. 1992, 33, 525–532.
• Marko-Varga G. et al. J. Chromatogr. 1990, 523, 173–188.
• Thermo Fisher Scientific Application Note 123, AN123, 2019.
• Schibler J.A. Am. Lab. 1997, 29–32.
• Thermo Fisher Scientific Technical Note 40, TN-40, 2019.
• Thermo Fisher Scientific Technical Note 43, TN-43, 2019.