Determination of Plant-Derived Neutral Oligo- and Polysaccharides

Význam tématu

Metoda HPAE-PAD umožňuje rozlišit a kvantifikovat neutrální oligo- a polysacharidy z rostlinných zdrojů bez nutnosti chemické derivatizace. Díky vysoké citlivosti i schopnosti separovat polymery se stupni polymerace přesahujícími možnosti konvenčních technik nachází široké uplatnění v potravinářské analytice, kontroly kvality a výzkumu sacharidových profilů.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem aplikace bylo vyvinout robustní HPAE-PAD metodiku pro separaci neutrálních oligo- a polysacharidů z rostlinných zdrojů. Demonstrace proběhla na příkladu amylopektinů (maltodextrin Maltrin M040) a fruktanů (inuliny z čekanky a dahlie), přičemž byla porovnána vhodnost sloupce (CarboPac PA1 vs PA100), složení eluentu (koncentrace NaOH a Na-acetátu) a průběh gradientu pro dosažení optimálních rozlišení.

Použitá metodika a instrumentace

Analytická technika: vysokovýkonná aniontová výměnná chromatografie s pulsně amperometrickou detekcí (HPAE-PAD).

• Chromatografická soustava Thermo Scientific Dionex BioLC: GP50 gradientní pumpa s vakuu­vacím degasem, ED50 elektrochemický detektor, E01 eluentní organizér, AS50 autosampler s termickou komorou.
• Kolony: Dionex CarboPac PA1 nebo PA100 (4 × 250 mm) analytické a odpovídající guard sloupce (4 × 50 mm).
• Eluenty: A – 100 nebo 150 mM NaOH, B – 100 nebo 150 mM NaOH s 500 mM až 1 M Na-acetátem.
• Detekční vlna: Waveform A (Au pracov­ní elekt­ro­da, Ag/AgCl refer­enční elekt­ro­da).
• Reagencie a standardy: deionizovaná voda 17,8 MΩ·cm, NaOH 50 %, Na-acetát anhydridní, inuliny z čekanky a dahlie, Maltrin M040.
• Konzumní materiál: PVDF stříkačkové filtry 0,45 μm, nylonové filtry 0,2 μm, autosamplerové vialky.

Hlavní výsledky a diskuse

Byl ukázán lepší výkon kolony PA100 oproti PA1 – až o 10 % více identifikovaných píků díky vyšší účinnosti a mírně nižší kapacitě. Pro Maltrin M040 poskytuje mírně konkávní gradient (50–450 mM Na-acetátu) lepší rozlišení středně až vysoko polymerovaných sacharidů. Zvýšení koncentrace NaOH z 100 na 150 mM prodlužuje retenci větších oligomerů, což lze využít pro některé vzorky. Fingerprint fruktanů z čekanky a dahlie odhalil odlišné distribuce stupňů polymerace. Ukázalo se, že přetížení vzorkem snižuje retenci a ostrost špiček, a že po řadě injekcí může dojít k vázání těžších polymerů na kolonu, což je nutné řešit periodickým čištěním silným elu­entem. Reprodukce injekcí je nejvyšší ve full-loop režimu (0,3 % RSD pro 25 µL), úspornější částečné režimy dosahují 1–2 % RSD.

Přínosy a praktické využití metody

HPAE-PAD poskytuje vysoké rozlišení sacharidových oligomerů a polymerů až do DP 80+, bez potřeby chemické modifikace. Metoda nachází uplatnění v potravinářské kontrole kvality (detekce ředění džusů, určení původu medu), vývoji a standardizaci prebiotik (inuliny, fruktooligosacharidy), analýze škrobových produktů a monitoring výrobních procesů.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se rozšíření miniaturizovaných kolonek (2 × 250 mm) pro nižší spotřebu eluentu a méně odpadu, nasazení alternativních elučních iontů (např. nitráty) pro lepší rozlišení větvených sacharidů, integrace s hmotnostní spektrometrií pro strukturální charakterizaci, plná automatizace přípravy vzorku a využití strojového učení pro pokročilou analýzu fingerprintů.

Závěr

Vyvinutá HPAE-PAD metodika na základě Dionex CarboPac PA100 a PA1 sloupců pro separaci neutrálních oligo- a polysacharidů je vysoce citlivá, přesná a reprodukovatelná. Nabízí široké možnosti aplikace v potravinářské a biochemické analytice s robustním provozem i pro složité vzorky s vysokým stupněm polymerace.

Reference

1. Rocklin RD, Pohl CA. J. Liq. Chromatogr. 1983;6:1577–1590.
2. Lee YC. J. Chromatogr. A. 1996;720:137–149.
3. Koizumi K et al. J. Chromatogr. 1989;464:365–373.
4. Hanashiro I, Abe J, Hizukuri S. Carbohydr. Res. 1996;283:151–159.
5. Koizumi K, Fukuda M, Hizukuri S. J. Chromatogr. 1991;585:233–238.
6. Thermo Fisher Scientific. Application Note 82; Sunnyvale, CA.
7. Swallow KW, Low NH. J. Agric. Food Chem. 1990;38:828–832.
8. van der Hoeven RAM et al. J. Chromatogr. 1992;627:63–73.
9. Campbell JM et al. J. Agric. Food Chem. 1997;45:3076–3082.
10. Chatterton NJ, Harrison PA. New Phytol. 1997;136:3–10.
11. Schols HA et al. Carbohydrates in the Netherlands. 1993;9:11–13.
12. Verbruggen MA et al. Carbohydr. Res. 1998;306:265–274.
13. Torto N et al. Anal. Chim. Acta. 1995;313:15–24.
14. Mou S, Sun Q, Lu D. J. Chromatogr. 1991;546:289–295.
15. McDougall GJ, Fry SC. Carbohydr. Res. 1991;219:123–132.
16. Thermo Fisher Scientific. Technical Note 21; Sunnyvale, CA.
17. Cooper GA, Rohrer JS. Anal. Biochem. 1995;226:182–184.
18. Thayer J et al. Anal. Biochem. 1998;256:207–216.
19. Rocklin RD et al. Anal. Chem. 1998;70:1496–1501.
20. Ammeraal RN et al. Carbohydr. Res. 1991;215:179–192.
21. Koch K, Andersson R, Aman P. J. Chromatogr. A. 1998;800:199–206.
22. Wong KS, Jane JJ. J. Liq. Chromatogr. 1995;18:63–80.
23. Giddings JC. United Separation Science. Wiley; 1991. p. 105.