Monitoring fluorescence resonance energy transfer (FRET) between GFP fusions in lysates of the yeast Saccharomyces cerevisiae using the Agilent Cary Eclipse

Význam tématu

Fluorescenční rezonance přenosu energie (FRET) nabízí nedestruktivní spektroskopickou metodu sledování blízkosti a orientace fluoroforů v biologických systémech. Využití variant zeleného fluorescenčního proteinu (GFP) spolu s modrým fluorescenčním proteinem (BFP) umožňuje studium proteinových interakcí a konformačních změn v reálném čase ve standardizovaných laboratorních podmínkách.

Cíle a přehled studie / článku

Studie si kladla za cíl demonstrovat možnost detekce a kvantifikace FRET mezi BFP a GFP v cytosolických lyzátech kvasinek Saccharomyces cerevisiae za pomoci spektrofluorimetru Agilent Cary Eclipse. Hlavní záměr spočíval ve sledování změn emisních spekter při proteolytickém štěpení peptidového spoje mezi fluorofory.

Použitá metodika a instrumentace

Pro přípravu vzorků byly kvasinkové buňky promyty a lyzovány činidlem Y-PER. Lyzáty se ředily Tris/HCl pufrem (pH 8) a umístily do plastových kyvet v multibuněčném držáku v komoře spektrofluorimetru při 25 °C. BFP byl excitován světlem o vlnové délce 360 nm, emisní spektra zaznamenána v rozsahu 400–550 nm před a po přidání trypsinu.

Použitá instrumentace

• Agilent Cary Eclipse Fluorescence Spectrophotometer
• Multicell Peltier držák
• Teplotní regulátor Peltier
• Quartzová kyveta 10 mm se zátkou
• Eclipse Thermal Software (Bio software package)

Hlavní výsledky a diskuse

Při excitaci BFP na 360 nm bylo patrné emise GFP kolem 510 nm díky FRET. Po přidání trypsinu a uvolnění BFP od GFP se intenzita emisního pásu GFP postupně snižovala, zatímco emise BFP mírně vzrůstala. Tímto bylo prokázáno, že zaznamenaná zelená emise vychází ze skutečného přenosu energie a nikoli z přímé excitace GFP.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda umožňuje kvantitativní sledování interakcí mezi proteiny nebo konformačních změn označených GFP variantami v buněčných lyzátech. Je vhodná pro studie protein–protein interakcí, testování ligandové vazby a dynamiky vnitrobuněčných procesů s vysokou citlivostí a minimálním rušením autofluorescencí.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se rozšíření FRET aplikací do živých buněk i organismus, integrace s mikroskopickými technologiemi pro prostorové zobrazení i kombinace s dalšími optickými metodami (FLIM, FCCS). Vývoj nových fluorescenčních proteinů s lepším spektrem a stabilitou dále zvýší šíři využití v biomedicínském výzkumu a průmyslové diagnostice.

Závěr

Agilent Cary Eclipse se systémem Peltier a multibuněčným držákem poskytuje spolehlivou platformu pro sledování FRET mezi GFP variantami v kvasinkových lyzátech. Demonstrovaná přístupnost a přesnost měření otevírá cestu k rozsáhlému využití při studiu proteinových interakcí a dynamiky v buněčných systémech.

Reference

1. Miyawaki R. et al. Fluorescent indicators for Ca2+ based on green fluorescent proteins and calmodulin. Nature, 1997;388:882–887.
2. Ha T. et al. Probing the interaction between two single molecules: Fluorescence resonance energy transfer between a single donor and a single acceptor. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1996;93:6264–6268.
3. Cubitt A.B. et al. Understanding, improving and using green fluorescent proteins. TIBS, 1995;20:448–455.
4. Gavin P., Prescott M. Cytosolic expression of green fluorescent protein (GFP) and its derivatives in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Fluorescence Application Note #5, 2001.
5. Mahajan N.P. et al. Bcl-2 and Bax interactions in mitochondria probed with green fluorescent protein and fluorescence resonance energy transfer. Nat. Biotechnol., 1998;16:547–552.
6. Prescott M. et al. Biochem. Biophys. Res. Commun., 1994;207:943–949.