Impurity Detection with a New Light Emitting Diode Induced Fluorescence Detector Coupled to the Agilent 7100 Capillary Electrophoresis System

Význam tématu

Detekce stopových nečistot v monoklonálních protilátkách představuje klíčový aspekt pro zajištění jejich kvality a bezpečnosti ve farmaceutickém průmyslu. Kapilární gelová elektroforéza doplněná fluorescenční detekcí umožňuje citlivé sledování těchto nečistot. Náhrada laserových zdrojů světelnými diodami (LED) nabízí nižší energetickou náročnost, vyšší stabilitu signálu a delší životnost přístroje.

Cíle a přehled studie

Studie se zaměřila na ověření výkonu nového detektoru LED-induced fluorescence (LEDIF) od společnosti Picometrics ve spojení s Agilent 7100 Capillary Electrophoresis System. Cílem bylo určit detekční a kvantifikační limity pro malé proteinové nečistoty ve vzorcích monoklonálních protilátek derivatizovaných činidlem FQ (3-(2-furoyl)-quinoline-2-carboxaldehyde).

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky monoklonální protilátky byly derivatizovány FQ reagencí za přítomnosti SDS, N-ethylmaleimidu a KCN. Oddělení probíhalo v 50 µm vnitřního průměru kapiláře se 33 cm celkové délky (efektivně 21 cm) při 40 °C, napájení 16,5 kV (500 V/cm) a injekce 5 kV po dobu 20 s. Detekce se prováděla 480 nm LED excitací a 510 nm emisním filtrem, fotonásobič pracoval s napětím 610 V a časem náběhu 0,5 s.

Použitá instrumentace

• Agilent 7100 Capillary Electrophoresis System (G7100A)
• Picometrics Zetalif LEDIF detektor s 480 nm LED a 510 nm high-pass filtrem
• Fused silica kapilára 50 µm id, 33 cm délka (21 cm efektivně)
• Autokapilární kondicionování: NaOH, HCl, SDS Gel Buffer, voda

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda prokázala kvantifikaci malých proteinových nečistot již od 0,05 % s S/N 8–40 a extrapolovanou detekční mez kolem 0,02 %. Přesnost (%deviation) dosahovala v průměru 7 % od cílové hodnoty a opakovatelnost (RSD) byla lepší než 10 % pro koncentrace ≥0,1 %. Tyto výsledky se blíží parametrům laserových systémů a potvrzují, že LED zdroje mohou poskytnout srovnatelnou citlivost.

Přínosy a praktické využití metody

• Vyšší energetická efektivita a nižší provozní náklady
• Stabilnější základní hladina signálu během dlouhých sekvencí měření
• Snížené nároky na údržbu díky delší životnosti LED zdrojů
• Možnost rutinního nasazení v QA/QC laboratořích biotechnologických výrob

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření LEDIF detekce na další derivatizační systémy a typy biomolekul
• Integrace s automatizovanými platformami on-line vzorkování
• Vývoj vícero vlnových délek pro multiplexní detekci
• Spojování LEDIF s hmotnostní spektrometrií pro komplexní charakterizaci produktů

Závěr

Nově představený LEDIF detektor ve spojení s Agilent 7100 CE poskytuje vysoce citlivou a opakovatelnou analýzu stopových proteinových nečistot v monoklonálních protilátkách. Dosahuje detekčních limitů srovnatelných s laserovými systémy a přináší provozní výhody v podobě nižší spotřeby energie, lepší stability a nižších nákladů na údržbu.

Reference

1. A. Guo et al. Capillary electrophoresis methods for pharmaceutical analysis; Vol. 9 of Separation Sciences and Technology Series; Academic Press, Chapter 14, 2008.
2. C. Wenz. Performance of commercially available gels for protein characterization by capillary gel electrophoresis with UV detection on the Agilent 7100 CE system; Agilent Technologies Application Note, 5990-7976EN.
3. O. Salas-Solano et al. Optimization and validation of a quantitative capillary electrophoresis sodium dodecyl sulfate method for quality control and stability monitoring of monoclonal antibodies. Anal. Chem. 78, 6583–6594 (2006).
4. D.A. Michels et al. Fluorescent derivatization method of proteins for characterization by capillary electrophoresis-sodium dodecyl sulfate with laser-induced fluorescence detection. Anal. Chem. 79, 5963–5971 (2007).
5. D.A. Michels, M. Parker, O. Salas-Solano. Quantitative impurity analysis of monoclonal antibody size heterogeneity by CE-LIF: example of development and validation through a quality-by-design framework. Electrophoresis 33, 815–826 (2012).
6. A. Rodat-Boutonnet et al. A comparative study of LED-induced fluorescence and laser-induced fluorescence in SDS-CGE: application to the analysis of antibodies. Electrophoresis 33, 1709–1714 (2012).