Fluorescence vs. UV Detection: Comparing Two CE-SDS Systems Using NISTmAb

Porovnání fluorescence a UV detekce v CE-SDS na modelu NISTmAb

Význam tématu

Separace a kvantifikace bílkovin metodou kapilární elektroforézy v přítomnosti SDS (CE-SDS) hraje klíčovou roli v kvalitativní a kvantitativní kontrole terapeutických monoklonálních protilátek. Volba detekční techniky (fluorescenční LEDIF vs. UV absorbance) ovlivňuje citlivost, šum baseliny a schopnost identifikovat vysokomolekulární agregáty.

Cíle a přehled studie

Cílem bylo srovnat dvě CE-SDS platformy při analýze standardního materiálu NISTmAb:

• Agilent ProteoAnalyzer s LED-indukovanou fluorescencí (LEDIF) a soupravou Protein Broad Range P240.
• System B s UV detekcí a příslušným proteinovým kitem.

Porovnání bylo založeno na zjištění monomerické čistoty, procenta glykanové obsazenosti, podílu thioetherové modifikace a rozlišení fragmentů NGHC/HC. Výsledky byly kalibrovány vůči referenčním hodnotám z NIST datasheetu.

Použitá metodika a instrumentace

• Agilent ProteoAnalyzer system (CE-SDS LEDIF): LED|Ex 470 nm, Protein Broad Range P240 kit (10–240 kDa), paralelní běh až 12 kapilár.
• System B (CE-SDS UV): UV lamp 260–280 nm, kapiláry pro analýzu až 8 vzorků souběžně, až 96 vzorků celkem.
• Příprava vzorků: NISTmAb 1000 ng/µL v PBS, redukované i neredukované podmínky, teplotní inkubace 70 °C, přídavek označovacího činidla (fluorescenční barviva) nebo SDS a interní standard (10 kDa marker).
• Protokoly separace: ProteoAnalyzer 30 min, System B 55–65 min v závislosti na stavu redukce, automatická analýza dat vestavěným softwarem.

Hlavní výsledky a diskuse

• Monomerická čistota: LEDIF 98,18 % vs. UV 98,32 % (NIST datasheet 98,47 %), oba systémy %CV ≤ 0,2 %.
• Glykanová obsazenost: LEDIF 99,30 % vs. UV 99,26 % (NIST 99,39 %), %CV ≤ 0,02 %.
• Thioether: LEDIF 0,40 % vs. UV 0,41 % (NIST 0,30 %), dobrá reprodukovatelnost (%CV ≤ 6,4 %).
• Rozlišení NGHC/HC: R = 1,60 pro oba systémy, splňuje požadavky (R ≥ 1).
• Baselina: LEDIF poskytuje téměř rovnou, nízkosumovou baseline a lepší detekci vysokomolekulárních agregátů. UV detekce vykazuje sklon k šumu a prokládání baseliny, vyžaduje manuální integraci špiček.

Přínosy a praktické využití metody

• LEDIF detekce na ProteoAnalyzeru přináší vyšší citlivost a jasně definované signály, vhodné pro detailní charakterizaci agregátů a nízkou úroveň šumu.
• UV detekce nabízí jednoduchou přípravu vzorků a robustní provoz, vhodnou pro rutinní kontroly v QA/QC laboratořích.
• Obě metody poskytují srovnatelná data pro kritické kvality protilátky (CQAs) a potvrzují validitu výsledků vůči referenci NISTmAb.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace algoritmů strojového učení pro automatickou detekci a kvantifikaci špiček.
• Vyšší multiplexování kapilár a zkrácení doby analýzy pro zvýšení průchodnosti vzorků.
• Vývoj nových fluorescenčních značek s posunutým excitačním/emisním spektrem pro snížení interference a rozšíření rozsahu aplikací.
• Propojení CE-SDS s hmotnostní spektrometrií pro komplexní profilaci modifikací bílkovin.

Závěr

Porovnání ukázalo, že LEDIF a UV detekční technologie v CE-SDS poskytují srovnatelně přesné a reprodukovatelné výsledky při analýze standardního materiálu NISTmAb. Výhodou fluorescenční detekce je nižší šum baseliny a lepší citlivost na agregáty, zatímco UV detekce nabízí jednodušší přípravu a rychlejší nasazení v rutinních provozech. Volba metody by měla zohlednit požadavky na citlivost, průchodnost a stupeň automatizace.

Reference

1. Agilent Protein Broad Range P240 Kit, Agilent Technologies quick guide, D0031125, 2023.
2. Dependable Denaturing Protein Electrophoresis: Agilent ProteoAnalyzer system, Agilent Technologies brochure 5994-6716EN, 2023.
3. NISTmAb Reference Material 8671, NIST Certificate SRM-8671, 2023.
4. Analysis of NIST Antibody on the Agilent ProteoAnalyzer System, Agilent Technologies technical overview 5994-6960EN, 2024.
5. Turner A. et al., Development of Orthogonal NISTmAb Size Heterogeneity Control Methods, Anal. Bioanal. Chem. 2018, 410(8), 2095–2110.