Underivatized amino acid analysis in wine by HILIC separation and mass detection

Význam tématu

Analýza aminokyselin ve víně poskytuje klíčový pohled na dostupnost dusíku pro kvasinky při fermentaci a ovlivňuje vznik aromatických sloučenin determinujících kvalitu finálního produktu. Množství a složení aminokyselin je významné nejen pro řízení průběhu výroby vína, ale i pro odhalování falšování a stanovení původu a odrůdy hroznů.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem bylo vyvinout citlivou a reprodukovatelnou metodu pro stanovení 22 pododvozených aminokyselin bez nutnosti chemické derivatizace, aplikovat ji na vzorek bílého vína a přesně kvantifikovat zejména prolin pomocí izotopově značeného interního standardu.

Použitá metodika a instrumentace

Metoda kombinuje hydrofobně-indukovanou interakční chromatografii (HILIC) na amide-fázované kolonce s jednovaným kvadrupólovým hmotnostním detektorem ve stereo­selektivním monitorovacím režimu (SIM). Příprava vzorku vyžaduje pouze filtraci a ředění HCl, bez dalšího čištění ani derivatizace.

• UHPLC systém: Thermo Scientific Vanquish Flex
• Kolonka: Accucore 150-Amide-HILIC (2,1 × 150 mm, 2,6 µm)
• Mobilní fáze: acetonitril/ammonium formiát pH 2,8 (90:10) a voda/ammonium formiát pH 2,8 (90:10)
• Hmotnostní detektor: Thermo Scientific ISQ EM (ESI, pozitivní i negativní režim SIM)
• Software: Chromeleon CDS 7.2.9

Hlavní výsledky a diskuse

Optimalizace slanosti mobilní fáze (20 mM ammonium formiátu) a parametrů iontového zdroje vedla k ostrým a symetrickým pí­kům 22 aminokyselin za 22 min. Lineární a kvadratické kalibrační křivky vykázaly koeficienty determinace R2 > 0,99, limity detekce spadají do stovek nanomolárního rozsahu. Opakovatelnost retence i plochy píků byla velmi dobrá (RT RSD < 0,1 %, plocha RSD < 10 %). Ve vzorcích vína se stanovilo 17 aminokyselin, z nichž prolin dosahoval až 39 % celkového obsahu. Kvantifikace prolinu pomocí interní kalibrace s prolin-2,5,5-d3 snížila vliv matrice a zlepšila přesnost i opakovatelnost oproti externí kalibraci.

Přínosy a praktické využití metody

• Odstranění derivatizace – nižší pracovní zátěž a riziko chirálních interferencí
• Citlivé stanovení i těžko separovatelných izomerů (Leu/Ile, Val/Nva)
• Rychlá analýza (22 min), jednoduchá příprava vzorku
• Vysoká reprodukovatelnost a robustnost vhodná pro rutinní kontrolu kvality
• Přesné stanovení prolinu pro diagnostiku odrůd a geografického původu

Budoucí trendy a možnosti využití

Rozšíření aplikace HILIC-MS na další potravinářské a biotechnologické matrice, integrace izotopových standardů pro široké spektrum aminokyselin, automatizace přípravy vzorků a nasazení vyspělejších MS detektorů (např. tandemové nebo vysokorozlišovací systémy) pro hlubší metabolomické profiling, autentizaci lahvových vín a monitoring fermentačních procesů.

Závěr

Popsaná HILIC-SIM metoda umožňuje bezderivátové, citlivé a reprodukovatelné stanovení aminokyselin ve víně i jiných vzorcích. Využití izotopově značeného interního standardu pro prolin významně snižuje vliv matrice a zvyšuje spolehlivost kvantifikace. Díky jednoduché přípravě a robustnosti je postup vhodný pro rutinní analytiku vína a souvisejících biotechnologických procesů.

Reference

1. Belda I, Ruiz J, Esteban-Fernández A a kol. Microbial contribution to wine aroma and its intended use for wine quality improvement. Molecules 2017;22:189–217.
2. Callejón RM, Troncoso AM, Morales ML. Determination of amino acids in grape-derived products: A review. Talanta 2010;81:1143–1152.
3. Lehtonen P. Determination of amines and amino acids in wine – A review. Am J Enol Vitic 1996;47:127–133.
4. Soufleros EH, Bouloumpasi E, Tsarchopoulos C, Biliaderis CG. Primary amino acid profiles of Greek white wines and their use in classification according to variety, origin and vintage. Food Chem 2003;80:261–273.
5. Gokmen V, Serpen A, Mogol BA. Rapid determination of amino acids in foods by HILIC–HRMS. Anal Bioanal Chem 2012;403:2915–2922.
6. Thermo Fisher Scientific. Application Note 72976: Identity confirmation and accurate quantitation of a genotoxic impurity by UHPLC-UV–SQ MS. 2019.