Native amino acid analysis in wine by HILIC separation and detection with single quadrupole mass spectrometry

Význam tématu

Aminokyseliny v víně hrají klíčovou roli jako zdroj dusíku pro kvasinky během fermentace a ovlivňují aromatický profil hotového nápoje. Měření jejich hladin je důležité pro kontrolu kvality (QA/QC), sledování technologických postupů a odlišení odrůd či oblastí původu vína.

Cíle a přehled studie

Cílem práce bylo vyvinout citlivou a reprodukovatelnou metodu pro stanovení 22 nativních (underivatizovaných) aminokyselin pomocí kapalinové chromatografie HILIC s detekcí jediným kvadrupólem hmotnostního analyzátoru (LC-SQMD). Metoda byla optimalizována pro rychlou analýzu bez předchozí derivatizace a následně aplikována na bílé víno k detekci 17 aminokyselin včetně kvantifikace prolinu.

Použitá instrumentace

• UHPLC: Thermo Scientific Vanquish Flex s Quaternary Pump, Split Sampler a Column Compartment
• Kolona: Accucore™ 150 Amide HILIC (2,1×150 mm, 2,6 μm)
• Detektor: Thermo Scientific ISQ Single Quadrupole MS s ESI (pozitivní ionizace, negativní pro Asp a Glu)
• Software: Chromeleon 7.2.8 pro řízení přístrojů a zpracování dat

Použitá metodika

Mobilní fáze sestávala z A: 90/10 (v/v) acetonitril/200 mM amonného formiátu pH 2,8 a B: 90/10 (v/v) voda/200 mM amonného formiátu pH 2,8. Průtok byl 0,4 mL/min, injekční objem 0,5 mL, teplota kolony 30 °C a vzorkovače 4 °C. Gradientní program dosáhl oddělení většiny aminokyselin do 22 minut. Jako interní standard pro prolín byla použita izotopicky značená forma prolin-2,2,5-d3.

Hlavní výsledky a diskuse

• Optimální koncentrace amonného formiátu 20 mM zlepšila tvar a retenční časy vybraných aminokyselin.
• Baseline separace byla dosažena pro 17 ze 22 párů sloučenin; izomery Leu/Ile a Nva/Val byly dobře rozlišené (Rs >5).
• Linearity v rozsahu 0,1–500 μM s koeficienty determinace R2 >0,991.
• Metoda umožnila detekci 17 aminokyselin ve vzorcích bílého vína, přičemž prolin byl kvantifikován interní kalibrací a vykázal vyšší přesnost a nižší variabilitu než kalibrace externí.

Přínosy a praktické využití

Navržená metoda eliminuje potřebu časově náročné a potenciálně rizikové derivatizace, zkracuje dobu analýzy a zvyšuje reprodukovatelnost. Je vhodná pro rutinní laboratorní provoz ve výrobě vína, potravinářském průmyslu a biotechnologii.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření o další biogenní aminy a organické kyseliny pro komplexní profilování vína.
• Implementace vysokorychlostních HILIC fází a vícekvadrupólových hmotnostních detektorů pro vyšší citlivost.
• Automatizace přípravy vzorků a online vzorkovače pro zvýšení throughputu.

Závěr

Vyvinutá LC-SQMD metoda na HILIC sloupci poskytuje rychlou a robustní analýzu 22 nativních aminokyselin bez derivatizace. Uplatnění interní kalibrace pro prolín posílilo přesnost měření ve složité matrici vína, což potvrzuje potenciál metody pro rutinní kontrolu kvality.

Reference

• P. Lehtonen: Determination of amines and amino acids in wine – A review, Am. J. Enol. Vitic. 47 (1996) 127–133.
• E. M. Sanders, C. S. Ough: Determination of free amino acids in wine by HPLC, Am. J. Enol. Vitic. 36 (1985) 43–46.
• V. Gokmen, A. Serpen, B. A. Mogol: Rapid determination of amino acids in foods by hydrophilic interaction liquid chromatography coupled to high-resolution mass spectrometry, Anal. Bioanal. Chem. 403 (2012) 2915–2922.