Anion exchange-based method for nucleotide sugar determination

Význam tématu

Analýza a kvantifikace aktivovaných nukleotidových cukrů, jako jsou UDP-hexosaminy a GDP-mannóza, je klíčová pro pochopení a kontrolu proteinové glykosylace. Tyto látky ovlivňují biologickou aktivitu, stabilitu a imunogenicitu rekombinantních terapeutických proteinů.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem aplikace bylo navrhnout rychlou, robustní a vysoce rozlišovací aniontově-výměnnou chromatografickou metodu pro separaci a kvantifikaci sedmi běžných nukleotidových cukrů za pomoci Thermo Scientific™ Dionex™ CarboPac™ PA1 kolony a ručně připravených elučních pufrů.

Použitá metodika a instrumentace

Byla vyvinuta 34minutová gradientní metoda na aniontově-výměnné kolóně CarboPac PA1 s detekcí UV při 262 nm. Metoda zahrnovala manuální přípravu 3 mM NaOH a 1,5 M NaOAc/3 mM NaOH jako eluenty.

• Thermo Scientific Dionex ICS-6000 RFIC systém se dvěma pumpami, degazérem, DAD detektorem (13 µL) a DC detektorem
• Dionex CarboPac PA1 analytická kolona 2 × 250 mm a guard kolona 2 × 50 mm
• Vzorkovací autosampler s chladicím modulem, 2,5 µL vzorkový smyčka
• UV detektor nastavený na 262 nm

Hlavní výsledky a diskuse

Na CarboPac PA1 koloně bylo v 34 min metodě odděleno sedm nukleotidových cukrů s většinou rozlišení R>1,5 (nejnižší R=1,2 mezi UDP-GlcNAc a UDP-GalNAc). Testy na alternativních IonPac AS11-HC a AS20 kolónách s generovaným KOH ukázaly, že i když je možné dosáhnout detekce kompatibilní s MS, nedosáhly lepší separace pro všech sedm analytů.

Preciznost retencí i ploch píků byla v rozsahu RSD<2,5 %. Linearity při koncentracích 1,25–80 mg/L měly koeficient determinace 0,996–1,000. S/N poměr pro LOQ (S/N=10) byl pro šest cukrů výrazně pod 1,25 mg/L, pouze pro UDP-GluA byl limit LOQ blíže testovací koncentraci. Spike recovery v proteinové matrici (BSA) byla 98,7–117 %, což potvrzuje dobrou přesnost metody.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda nabízí rychlou a reprodukovatelnou analýzu klíčových nukleotidových cukrů vhodnou pro výzkumná i QC pracoviště. Je jednoduchá na přípravu elučních roztoků, nevyžaduje drahé eluční generátory a dobře se uplatní pro UV detekci v rutině.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Nasazení nových CarboPac kolón s menšími částicemi pro zkrácení analýzy a zvýšení rozlišení
• Implementace MS detekce se supresí KOH eluentu pro rozšířenou identifikaci a kvantifikaci dalších nukleotidových cukrů
• Automatizace přímé přípravy vzorků a elučních pufrů
• Integrace s on-line kvenchovacím zařízením pro monitoring buněčných kultur v reálném čase

Závěr

Vyvinutá HPAE-UV metoda na Dionex CarboPac PA1 koloně umožňuje za 34 min vysoce rozlišit sedm hlavních nukleotidových cukrů s vynikající precizností, linearitou a přesností. Výsledky potvrzují vhodnost metody pro rutinní analýzu v biopharma průmyslu i výzkumu.

Reference

1. Grammatikos SI et al. Biotechnol. Prog. 1998, 14, 410–419.
2. Reiter WD. Curr. Opin. Plant Biol. 2008, 11, 236–243.
3. Kochanowski N et al. Anal. Biochem. 2006, 348(2), 243–251.
4. Jefferis R. Trends Pharmacol. Sci. 2009, 30(7), 356–362.
5. Räbinä J et al. Glycoconj. J. 2001, 18, 799–805.
6. Ryll T, Wagner R. J. Chrom. B 1991, 570(1), 77–88.
7. Nyberg GB et al. Biotechnol. Bioeng. 1999, 62, 336–347.
8. Gu X, Wang DIC. Biotechnol. Bioeng. 1998, 58, 642–648.
9. Sweeney C et al. Biochem. J. 1993, 290, 563–570.
10. Lehmann R et al. Electrophoresis 2000, 21, 3010–3015.
11. Preinerstorfer B et al. J. Chromatogr. A 2010, 1217, 312–328.
12. Thermo Scientific TN-72580, 2022.
13. Thermo Scientific TN-72210, 2022.
14. Tomiya N et al. Anal. Biochem. 2001, 293(1), 129–137.
15. Marcellin E et al. Biotechnol J. 2009, 4(1), 58–63.
16. Thermo Scientific Technical Note 71, 2022.
17. Lindhout M et al. Clin. Chim. Acta. 2010, 411(13–14), 980–983.
18. Kochanowski N et al. Anal. Biochem. 2006, 348(2), 243–251.
19. Sesma JI et al. J. Biol. Chem. 2009, 284(18), 12572–12583.
20. Nakajima K et al. Glycobiology 2010, 20(7), 865–871.
21. Oikari S et al. J. Chromatogr. A 2014, 1323, 82–86.
22. Alonso AP et al. Plant Physiol. 2010, 153(3), 915–924.
23. del Val IJ et al. Anal. Biochem. 2013, 443(2), 172–180.
24. Lee R et al. Anal Biochem. 1996, 242(1), 1–7.
25. Liljebjelke K et al. Anal. Biochem. 1995, 225(2), 296–304.
26. Villafraz O et al. mBio. 2021, 12(3), e0037521.
27. Palmieri MJ et al. Anal. Biochem. 1991, 194(2), 388–393.
28. Schumann B et al. Mol. Cell. 2020, 78(5), 824–834.
29. Hull SR, Montgomery R. Anal. Biochem. 1994, 222(1), 49–54.