Automated Phospholipid Fatty Acid (PLFA) Analysis using the Sherlock™ PLFA Software Package on a Shimadzu GC-2010/2030

Význam tématu

Analýza fosfolipidových mastných kyselin (PLFA) v půdních a sedimentních vzorcích poskytuje okamžitý obraz o živé mikrobiální komunitě. Díky citlivému a specifickému značení biomarkerů umožňuje sledovat změny mikrobioty vyvolané environmentálními vlivy či managementem ekosystému.

Cíle a přehled studie / článku

Hlavním cílem bylo demonstrovat automatizovanou identifikaci a kvantifikaci PLFA z říčního sedimentu (vzorek KY-RIVER-27) pomocí high throughput extrakčního protokolu a softwaru Sherlock PLFA na přístroji Shimadzu GC-2010 Plus. Metoda slouží ke zkrácení doby analýzy, snížení spotřeby činidel a eliminaci manuálních chyb.

Použitá metodika

Postup zahrnoval:

1. Přidání interního standardu 1,2-dinonadecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (19:0 PC).
2. Extrakci PLFA z usazenin podle high throughput protokolu.
3. Výběr a načtení metody PLFAD2 v Sherlock Sample Processor, automatické nastavení parametrů v Shimadzu LabSolutions.
4. Spuštění kalibrace standardní směsi, hexanového blanku a vzorku.
5. Automatické přiřazení názvů špiček a výpočet hmotnostních procent v Sherlock PLFA software.

Použitá instrumentace

• Shimadzu GC-2010 Plus
• Autosampler AOC-20i a AOC-20S
• Kolonka J&W Ultra 2 (25 m × 0,2 mm × 0,33 μm)
• Split liner (Shimadzu p/n 220-94766-00)
• Stříkačka 10 μL s fixní jehlou (Shimadzu p/n 221-34618-00)
• Carrier gas: vodík, konstantní rychlost 47,7 cm/s
• Program pece: 190 °C, 10 °C/min do 285 °C (9,5 min), 60 °C/min do 310 °C (0,42 min)
• Split ratio: 30:1, injekční objem: 2,0 μL
• FID: 300 °C
• Software: MIDI Sherlock v6.3B PLFAD2 v2.00, Shimadzu LabSolutions v5.85

Hlavní výsledky a diskuse

Automatizovaná analýza odhalila 36 mastných kyselin s 100% pojmenováním špiček. Nejvyšší zastoupení v mol % měly 16:1 w7c (16,85 %), 16:0 (14,84 %) a 18:1 w7c (12,55 %). Biomasa byla rozdělena následovně: Gram-negativní bakterie 59,36 nmol/g, Gram-pozitivní 30,98 nmol/g, arbuskulární mykorhizní houby 6,59 nmol/g, saprotrofní houby 4,62 nmol/g, aktinomycety 7,23 nmol/g a další eukaryota 15,70 nmol/g (celkem 161,81 nmol/g). Důležité poměry: Gram+/Gram– = 0,50, Fungi/Bacteria = 0,12, Saturated/Unsaturated = 0,69, Mono/Poly = 3,31. Celý proces analýzy dat do výpočtu biomasy a poměrů trval méně než 5 minut.

Přínosy a praktické využití metody

• Automatizace snižuje subjektivitu a riziko chyb při pojmenování špiček.
• Vysoká propustnost umožňuje rychlé zpracování velkého množství vzorků.
• Možnost vizualizace výsledků (2D grafy, dendrogramy) a export do Excelu či Accessu.
• Uživatelsky definovatelná přiřazení PLFA do mikrobiálních skupin pro specifické aplikace.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace s GC-MS a dalšími spektrometrickými technikami pro rozlišení většího množství biomarkerů.
• Propojení PLFA dat s metagenomikou a bioinformatikou pro komplexnější analýzy ekosystému.
• Online monitorování kvality půdy a sedimentů v reálném čase pro environmentální monitoring.
• Aplikace v precizním zemědělství pro sledování dopadů agrotechnických zásahů na mikrobiální společenstva.

Závěr

Automatizovaná PLFA analýza pomocí Sherlock PLFA softwaru na platformě Shimadzu GC-2010/2030 představuje rychlou, reprodukovatelnou a snadno implementovatelnou metodiku pro studium živých mikrobiálních komunit v půdách a sedimentech. Vysoká citlivost, minimalizace chyb a flexibilita v přiřazování PLFA do mikrobiálních skupin umožňují široké využití jak ve výzkumu, tak v průmyslové praxi.

Reference

• Buyer J.S., Sasser M. High throughput phospholipid fatty acid analysis of soils. Applied Soil Ecology 61, 127–130, 2012.