LC-MS quantitative screening method for 18 anabolic steroids in oral fluid using MS2 spectra data collected with Q Exactive Orbitrap mass spectrometer

Význam tématu

Analýza androgenně-anabolických steroidů v biologických vzorcích je klíčová pro kontrolu dopingu, klinickou toxikologii a průmyslové standardy kvality. Orální tekutina představuje neinvazivní alternativu krevních a močových vzorků, umožňuje rychlé odběry a je vhodná pro monitorování krátkodobých expozic.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo vyvinout citlivou, specifickou a robustní kvantitativní metodu pro screening 18 anabolických steroidů v orální tekutině. Autoři implementovali vysoce rozlišovací Q Exactive Orbitrap pro získávání MS2 spekter s iontovým poměrem pro potvrzení identity.

Použitá metodika a instrumentace

• Vzorkování a příprava vzorků: likvidně-lihová extrakce (LLE) orální tekutiny (200 µL) s vnitřním standardem (testosteron 13C3).
• Chromatografie: Thermo Acucore C18 kolona (100×3 mm, 2.6 µm), mobilní fáze A (0,2 % kyselina mravenčí ve vodě), B (0,1 % kyselina mravenčí v methanolu), C (ACN/IPA/acetone 45/45/10), 15 min gradient.
• Hmotnostní spektrometrie: Thermo Scientific Q Exactive Orbitrap s APCI ionizací, rozlišení 35 000, t-MS2 režim, izolační šířka 2 m/z, optimalizované kolizní energie a iontová množství pro MS2.
• Detekční a kvantifikační přístup: výběr dvou nejintenzivnějších fragmentů pro každý analyzát, výpočet iontového poměru dle EU směrnic.

Hlavní výsledky a diskuse

• Meze stanovení: LLOQ 1 ng/mL (pro 6β-hydroxyfluoxymesteron 6 ng/mL), lineární rozsah 1–1500 ng/mL s R2 > 0,99 u většiny analytů.
• Preciznost: intra-assay RSD < 15 %, inter-assay RSD < 20 % ve čtyřech úrovních (2, 15, 90, 450 ng/mL).
• Obnova a matrix efekt: průměrná procentuální obnova 78,5–118 %, bez výrazných matrix efektů.
• Identifikace v reálných vzorcích: detekce testosteronu a epitestosteronu v dobrovolnických vzorcích zpracovaných proteinovou precipitací.
• Potvrzení identity: vysoká přesnost m/z (< 5 ppm) a iontové poměry pro eliminaci falešně pozitivních výsledků.

Přínosy a praktické využití metody

• Neinvazivní odběr orální tekutiny, minimální objem vzorku, rychlé zpracování.
• Vysoká specifičnost a citlivost díky HRMS a MS2 potvrzení.
• Využití v laboratořích kontroly dopingu, klinické a forenzní toxikologii, QA/QC v potravinářském a farmaceutickém průmyslu.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření počtu cílových sloučenin včetně metabolitů a nových dopingových látek.
• Automatizace přípravy vzorků a integrace s datovými platformami pro rychlé vyhodnocování.
• Vývoj miniaturizovaných a přenosných HRMS systémů pro on-site testování.
• Implementace nestrukturovaného (non-targeted) screeningového přístupu pro objev nových analytů.

Závěr

Vyvinutá LC-MS2 metoda na Q Exactive Orbitrap umožňuje spolehlivou, citlivou a rychlou kvantifikaci 18 anabolických steroidů v orální tekutině. Metoda splňuje přísné požadavky lineárnosti, citlivosti i preciznosti a nachází široké uplatnění v oblasti kontroly dopingu i klinické toxikologie.

Reference

1. Draft SANCO 1805/2000 Rev.1, Revised Commission Decision 93/256, 14 April 1993.
2. Council Directive 96/23/EC, laying down performance criteria for analytical methods for residues in live animals and animal products.