LC-MS Quantitative Screening Method for 18 Anabolic Steroids in Oral Fluid Using MS2 Spectra Data Collected with Q Exactive Orbitrap Mass Spectrometer

Význam tématu

Androgenicko-anabolické steroidy jsou široce zneužívány ve sportu i klinických aplikacích. Spolehlivá detekce těchto látek v biologických vzorcích je klíčová pro antidopingové řízení, forenzní toxikologii a QA/QC v průmyslové analýze.
Orální tekutina představuje neinvazivní matrici s jednoduchou přípravou vzorku, vhodnou pro rychlý a opakovatelný screening.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem studie bylo navrhnout a validovat kvantitativní LC–MS/MS metodu pro simultánní screening 18 anabolických steroidů v orální tekutině. Metoda kombinuje extrakci kapalina–kapalina, 15minutový chromatografický gradient a potvrzení složené z poměru dvou fragmentů získaných v MS2 spektru.

Použitá metodika a instrumentace

Sample preparation:

• 200 µL orální tekutiny s konzervačním pufrem
• 40 µL interního standardu (testosteron-13C3)
• LLE s 1 mL MTBE, mražení, odpařování, rekonstituce v 50 % MeOH
• Injekce 30 µL do LC

Liquid chromatography:

• Kolona Thermo Accucore C18 (100×3 mm, 2,6 µm)
• Mobilní fáze A: 0,2 % HCOOH/voda, B: 0,1 % HCOOH/MeOH, C: ACN/IPA/Aceton (45:45:10)
• Gradient 15 min

Mass spectrometry:

• Q Exactive Orbitrap (HRMS)
• Ionizace APCI, rozlišení 35 000
• Režim t-MS2 s inclusion list, isol. šířka 2 m/z, AGC target 2e5, max IT 250 ms
• Potvrzení: poměr dvou fragmentů dle EU směrnic

Hlavní výsledky a diskuse

LLOQ metody činí 1 ng/mL pro 17 analyzů, u 6β-hydroxyfluoxymesteronu je 6 ng/mL. Lineární rozsahy dosahují 1–1500 ng/mL (R2 > 0,98). Matrixové efekty jsou minimální (recovery 78,5–131 %). Intra- a inter-assay přesnost (RSD) je ≤ 20 %. Metoda prokázala spolehlivou detekci ve vzorcích od dárců, včetně negativních i pozitivních kontrol.

Přínosy a praktické využití metody

Vysoká specifita i citlivost díky HRMS2 potvrzení fragmentů. Neinvazivní odběr orální tekutiny umožňuje on-site screening sportovců. Metoda je vhodná pro antidopingové laboratoře, forenzní toxikologii i průmyslovou kontrolu jakosti.

Budoucí trendy a možnosti využití

Rozšíření panelu detekovaných steroidů a metabolitů. Integrace s online databázemi MS2 spekter a automatizace přípravy vzorků. Vývoj mobilních HRMS systémů pro field testing. Kombinace orální tekutiny s dalšími matricemi pro komplexní screening.

Závěr

Vyvinutá metoda poskytuje robustní a citlivý kvantitativní screening 18 anabolických steroidů v orální tekutině. Díky vysokému rozlišení a potvrzení poměru fragmentů zajišťuje vysokou spolehlivost výsledků, což je klíčové pro dopingový a forenzní monitoring.

Reference

1. Draft SANCO 1805/2000 Rev.1: Směrnice EU pro výkonnostní kritéria analytických metod reziduí v živočišných produktech, 1993.