CASSS: Developing a high-resolution LC-MS method for spent media analysis in biopharm upstream process development

Význam tématu

Optimalizace složení kultivačního média je klíčová pro vývoj biotechnologických procesů vedoucích k produkci terapeutických proteinů. Přesná charakterizace a kvantifikace živin ve startovních a spotřebovaných médiích umožňuje řízené dávkování a zvyšuje výtěžnost i kvalitu cílových produktů. High-resolution LC-MS metodika přináší rychlé a citlivé sledování řady složek, včetně aminokyselin a dalších vodou rozpustných látek.

Cíle a přehled studie

Hlavním cílem bylo vyvinout a validovat 20minutovou LC-MS metodu na platformě BioAccord pro analýzu surového i spotřebovaného buněčného média. Studie demonstruje kvantifikaci 18 aminokyselin ve startovním médiu a sledování více než 100 sloučenin během klonové selekce v procesu upstream vývoje.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky: Spotřebované médium naředěné 1:500 v 0,1% kyselině mravenčí s interním standardem 3-chlorotyrosinem.
Kalibrace: Standardní roztoky aminokyselin naředěné 0,1% kyselinou mravenčí; kvantifikace při 1:2000 ředění.

• Chromatografie: Acquity Premier HSS T3, rozměr 2,1×150 mm, fáze A – voda/0,1% FA, fáze B – 90% acetonitril/10% isopropanol/0,1% FA.
• Hmotnostní spektrometrie: full-scan ESI+ a ESI–, vysoké rozlišení.
• Software: waters_connect pro řízení akvizice i zpracování dat.

Hlavní výsledky a diskuse

1. Kvantifikace aminokyselin v surovém médiu ukázala lineární rozsahy od 0,01 do 10 µM (některé až 0,5–10 µM), koeficienty determinace (R2) ≥ 0,997. Všechny aminokyseliny vykázaly přesnost 86–104 % a RSD ≤ 5 %, s výjimkou glycinů poblíž LOD.
2. Monitorování spotřebovaného média během klonové selekce detekovalo přes 100 metabolitů z knihovny. Porovnání pěti subklonů odhalilo rozdíly ve spotřebě aminokyselin – subklon 2 byl nejblíže rodičovské linii, subklon 4 vykazoval odlišný profil.
3. Extrahované iontové chromatogramy a log-log kalibrační křivky potvrdily reprodukovatelnost oddělení i citlivost detekce.

Přínosy a praktické využití metody

• Rychlá a robustní platforma pro rutinní QC surového i spotřebovaného média ve vývojových projektech.
• Schopnost simultánně sledovat desítky až stovky analytů usnadňuje rozhodování v reálném čase.
• Metoda je vhodná pro procesní charakterizaci, optimalizaci krmného režimu i výběr klonů.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření knihoven o vitaminy, cukry a lipidy pro komplexnější metabolomiku média.
• Integrace dat s online senzory a modelováním pro prediktivní řízení procesu.
• Nasazení automatizované přípravy vzorků pro vysokopropustné screeningy.

Závěr

Navržená LC-MS metodika na BioAccord systému poskytuje citlivou a reprodukovatelnou analýzu klíčových složek buněčného média. Validace pro aminokyseliny potvrdila vhodnost pro rutina QC a vývoj upstream procesů, zatímco aplikace na klonovou selekci ukázala praktický přínos při výběru optimálních buněčných linií.