Efficient Purification of Synthetic Peptides at High and Low pH

Význam tématu

Peptidové terapeutika zaznamenala v posledních desetiletích výrazný rozvoj a vyžadují vysoce čisté produkty pro další analýzy, vývoj a kontrolu kvality.

Cíle a přehled studie

Tato aplikace předkládá workflow pro vývoj analytických metod a následnou preparativní purifikaci syntetických peptidů při nízkém i vysokém pH na jediném HPLC systému s automatizovaným přepínáním mezi režimy.

Použitá metodika a instrumentace

• HPLC systém Agilent 1290 Infinity II Autoscale s UV a MSD detekcí
• Analytické kolony InfinityLab Poroshell 120 SB-C18 a HPH-C18, rozměry 4.6×150 mm, 4 µm
• Preparativní kolony InfinityLab Poroshell 120 SB-C18 a HPH-C18, rozměry 21.2×150 mm, 4 µm
• Agilent Jet Stream Electrospray zdroj a OpenLab CDS ChemStation software
• Solventy: ACN, metanol, voda, formová a trifluoroctová kyselina, amoniak, amonná sůl
• Automatizované ventily pro přepínání fází (2-, 4- a 6-polohové) a měřítek

Hlavní výsledky a diskuse

• Zaměřené gradienty zlepšily rozlišení mezi cílovým peptidem (angiotensin I) a vedlejšími produkty při obou pH
• Přenos metodiky z analytické na preparativní kolonu využitím HPLC Advisor App umožnil 200× vyšší nálože (20–30 mg)
• Frakční kolekce aktivovaná na základě UV a hmotnostně selektivního signálu vedla k separaci cílové frakce do několika 6s časových řezech
• Při reanalýze frakcí byla dosažena čistota nad 95 % ve většině vzorků, většina frakcí vykazovala čistotu >99 %
• Impurity, včetně možných sekvenčních delecí, byly detekovány a identifikovány díky vysoké selektivitě MSD

Přínosy a praktické využití metody

Integrovaný přístup minimalizuje časové i materiálové nároky spojené se změnou systémů, zvyšuje flexibilitu pro analýzu i purifikaci a umožňuje pooling pouze nejčistších frakcí.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Nasazení vysokorozlišovací MS k podrobné charakterizaci nečistot a degradantů
• Využití strojového učení pro automatickou optimalizaci gradientů a provozních parametrů
• Rozšíření metod na purifikaci větších biopolymerů a komplexních směsí
• Implementace zelených rozpouštědel a kontinuálních purifikačních technik

Závěr

Předložený postup prokázal efektivní purifikaci syntetických peptidů při různých pH na jednom plně automatizovaném HPLC systému, přinášící vyšší produktivitu, flexibilitu a kvalitu výsledného produktu.

Reference

1. Muttenthaler M et al. Trends in Peptide Drug Discovery. Nat Rev Drug Discov. 2021;20:309-325.
2. Penduff P. Analytical to Preparative HPLC Method Transfer. Agilent Technologies technical overview 5991-2013EN;2013.