Conformational Studies Using Second Derivative UV-Vis Absorption Spectroscopy

Význam tématu

Monoklonální protilátky (mAb) představují klíčová léčiva v moderní medicíně, přičemž vznik biosimilars – kopií původních („innovator“) protilátek – je umožněn po vypršení patentové ochrany. Porovnání konformační stability inovátoru a biosimiláru je nezbytné pro zajištění jejich ekvivalence a bezpečnosti.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem studie bylo ukázat využití druhé derivace UV-Vis absorpce k hodnocení mikroprostředí aromatických aminokyselin (tryptofanu, tyrosinu, fenylalaninu) v molekulách rituximabu a jeho biosimiláru. Data pořízená na spektrofotometru Agilent Cary 60 byla analyzována v softwaru Cary WinUV, přičemž srovnání fokusovalo na posun negativního vrcholu kolem 291 nm jako indikátor dlouhodobé stability a denaturace protilátek v přítomnosti denaturantu guanidinu chloridu (GdnHCl).

Použitá metodika a instrumentace

• Spectrofotometr Agilent Cary 60 UV-Vis (Xenonová blesková lampa, široký vlnový rozsah 240–350 nm, data interval 0,5 nm).
• Software Cary WinUV pro výpočet druhé derivace absorpce pomocí Savitzky–Golayova filtru (5 bodů) a spline interpolace (0,01 nm rozlišení).
• Vzorky připravené v Tris HCl pH 6,0 (500 mg/mL protilátky) a řízená denaturace GdnHCl v rozsahu 0–6 M.
• Quartz kyveta 1 cm, objem 3 mL, měření při pokojové teplotě.
• Referenční L-aminokyseliny (Phe, Trp, Tyr) z Agilent Technologies, reagencie ze Sigma-Aldrich.

Hlavní výsledky a diskuse

• Spektra první a druhé derivace pro volné aminokyseliny a protilátky identifikovala charakteristické negativní vrcholy kolem 283–294 nm.
• U obou mAb se s narůstající koncentrací GdnHCl posunul negativní vrchol ~291 nm, což indikuje podobné změny mikroprostředí tryptofanu během denaturace.
• Denaturační křivky ukázaly, že innovator i biosimilár vykazují podobnou citlivost na GdnHCl (kritický bod denaturace středními koncentracemi).
• Poměr a/b (tyrosin vs. tryptofan) se změnil z ~1,05 při nízkých koncentracích GdnHCl na vyšší hodnoty při úplné denaturaci, což potvrzuje vystavení tyrosinových zbytků vlivem rozvinutí globulární struktury.

Přínosy a praktické využití metody

• Druhá derivace UV-Vis absorpce nabízí rychlou, nekonzumativní a citlivou alternativu ke komplexním technikám (CD, fluorescence, HPLC) pro hodnocení vyšší struktury mAb.
• Metoda nevyžaduje drahé reagentní soupravy a umožňuje snadnou integraci do QC postupů v biotechnologických laboratořích.
• Přímé porovnání innovator vs. biosimilar zajišťuje transparentnost a podporuje regulační schvalovací proces biosimilars.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření aplikace na další třídy biologik (rekombinantní proteiny, fúzní proteiny) pro screening stability během vývoje.
• Integrace s mikrofluidními systémy pro vysokopropustné paralelní měření a online monitoring denaturace.
• Vývoj pokročilých algoritmů pro automatizovanou analýzu derivovaných spekter a předpověď stability na základě strojového učení.

Závěr

Studie potvrdila, že Agilent Cary 60 UV-Vis spektrofotometr ve spojení s druhou derivací absorpce poskytuje vysoce přesné informace o mikroprostředí aromatických zbytků v mAb. Innovator a biosimilar rituximabu vykazují podobný profil denaturace a stabilitu, což podporuje jejich ekvivalenci na úrovni vyšších struktur. Tato nenáročná metoda je perspektivním doplňkem QA/QC v biopharmaceutickém průmyslu.

Reference

1. Scott A., Wolchok J., Old L. Antibody therapy of cancer. Nat. Rev. Cancer 2012, 12, 278–287.
2. Udpa N., Million R. Monoclonal antibody biosimilars. Nat. Rev. Drug Discov. 2016, 15, 13–14.
3. Pace C.N., Scholtz J.M. Measuring the conformational stability of a protein. In Protein Structure: A Practical Approach; Oxford University Press, 1997; pp. 299–321.
4. Zheng K., Bantog C., Bayer R. The impact of glycosylation on monoclonal antibody conformation and stability. mAbs 2011, 3(6), 568–576.
5. Levine R., Federici M. Quantitation of aromatic residues in proteins: model compounds for second-derivative spectroscopy. Biochemistry 1982, 21, 2600–2606.
6. Mach H., Middaugh C.R. Simultaneous Monitoring of the Environment of Tryptophan, Tyrosine, and Phenylalanine Residues in Proteins by Near-Ultraviolet Second-Derivative Spectroscopy. Anal. Biochem. 1994, 222, 323–331.
7. Agilent Technologies. Comparison of Biosimilar and Innovator Monoclonal Antibody Rituximab Using the Agilent 1260 Infinity Bio-inert LC System and Agilent OpenLAB Match Compare Software. Application Note 5991-4920EN.
8. Ragone R., Colonna G. Determination of tyrosine exposure in proteins by second-derivative spectroscopy. Biochem. 1984, 23(8), 1871–1875.
9. Katayama D., Nayar R. Solution behavior of a novel type I interferon, interferon-τ. J. Pharm. Sci. 2005, 94, 2703–2715.