Evaluation of SEC-MALS Data Quality with Premier Protein SEC Columns

Význam tématu

SEC spojená s multiúhlovým rozptylem světla (SEC-MALS) představuje klíčový přístup pro detailní charakterizaci velkých biomolekul, zejména proteinů. Umožňuje stanovit molekulovou hmotnost, stupeň agregace, hydrodynamický poloměr i konformaci, což je zásadní pro vývoj a kontrolu kvality bioterapeutik.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem studie bylo porovnat úroveň šumu signálu v SEC-MALS měřeních na nových Premier Protein SEC kolonkách (XBridge Premier Protein SEC 250 Å, 2.5 µm a ACQUITY Premier Protein SEC 250 Å, 1.7 µm) oproti tradičním Waters BEH a diol-bonded křemíkovým kolonkám. Součástí bylo i stanovení molekulové hmotnosti (MW) monoklonálního protilátkového léku trastuzumabu a jeho velikostních variant.

Použitá metodika a instrumentace

• Chromatografický systém: ACQUITY UPLC H-Class PLUS Bio System (Empower 3)
• Detekce UV: ACQUITY UPLC TUV detektor (280 nm, 5 mm flow cell)
• MALS detektor: Wyatt µDAWN (datový sběr 2–5 Hz)
• Kolonky:
  • XBridge Premier Protein SEC 250 Å, 2.5 µm, 7.8×300 mm
  • ACQUITY Premier Protein SEC 250 Å, 1.7 µm, 4.6×300 mm
  • ACQUITY UPLC Protein BEH SEC 200 Å, 1.7 µm, 4.6×300 mm
  • BioResolve SEC mAb 200 Å, 2.5 µm, 7.8×300 mm
  • Diol-bonded silica SEC 250 Å, 5 µm, 7.8×300 mm
• Mobilní fáze: 2× DPBS (Dulbecco's PBS)
• Teploty: kolonka – ambient, vzorek – 10 °C
• Objem injekce: 10 µL (7.8 mm i.d.), 3.5 µL (4.6 mm i.d.)
• Průtok: 0.75 mL/min (7.8 mm i.d.), 0.38 mL/min (4.6 mm i.d.)

Hlavní výsledky a diskuse

• Úroveň šumu signálu MALS byla u Premier Protein SEC kolonek 1.5–2× vyšší než u ACQUITY BEH 200 Å a BioResolve kolonek, avšak významně nižší než u diol-bonded silica kolonek (2.5–4×).
• U diol-bonded silica kolonek se navíc objevily časné arteficiální vrcholy spojené s uvolňováním částic v důsledku tlakové pulzace.
• Poměr signálu k šumu (S/N) pro monomer trastuzumabu byl na Premier kolonkách o 1.5–2× nižší než na BEH a BioResolve, zatímco u diol-silica kolonek byl až o řád nižší.
• Stanovení MW monomeru a dimeru (HMWS1) bylo konzistentní ve všech sloupcích. U nízkomolekulárních variant (LMWS1 a LMWS2) se projevila vyšší variabilita kvůli částečnému prolínání s hlavním píkem nebo nízké abundanci.

Přínosy a praktické využití metody

SEC-MALS na Premier Protein SEC kolonkách poskytuje spolehlivou a reprodukovatelnou charakterizaci proteinových bioterapeutik s nízkým šumem a minimálním uvolňováním částic. Metoda podporuje kontrolu kvality, vývoj formulací a porovnání biosimilars.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Další optimalizace povrchu kolonek pro snížení šumu a zvýšení selektivity separace.
• Kombinace SEC-MALS s dalšími detektory (viskozita, DLS, izotachoforéza) pro komplexní profilování biopolymérů.
• Automatizace datové analýzy a využití strojového učení pro predikci konformace a stability proteinů.
• Rozšíření aplikací na jiné biologické makromolekuly, například lipidové komplexy a nanoděličky.

Závěr

Premier Protein SEC kolony pro SEC-MALS vykazují vynikající datovou kvalitu s nízkým šumem v porovnání s tradičními BEH a diol-silica sloupci. Umožňují přesné a konzistentní stanovení molekulové hmotnosti bioterapeutik, což podporuje jejich využití v QC a vývoji biosimilars.

Reference

• 1. Some D., Amartely H., Tsadok A., Lebendiker M. Characterization of Proteins by SEC-MALS. J. Vis. Exp. 2019; (148):e59615.
• 2. Huang R.Y.-C. et al. Integrated Approach for Characterizing Bispecific Antibody/Antigens Complexes. Anal. Chem. 2020;92:10709–10716.
• 3. Koza S.M., Chen W. Improving SEC-MALS Data Quality with BEH Columns. Waters App. Note 2018, 720006289.
• 4. Koza S.M., Yang H., Yu Y.Q. Expanding SEC Platform Versatility Using Premier Protein SEC Columns. Waters App. Note 2022, 720007500.
• 5. Koza S.M., Yang H., Yu Y.Q. Modern SEC Separations of Biosimilar Antibodies. Waters App. Note 2022, 720007484.
• 6. Koza S.M., Yang H., Yu Y.Q. Column Lifetimes at Physiological pH for Polysorbate Formulations. Waters App. Note 2022, 720007523.
• 7. Yang H., Koza S.M., Yu Y.Q. USP Monograph mAb SEC Method Robustness on XBridge Premier SEC. Waters App. Note 2021, 720007481.