Physicochemical Characterization of Coformulated Monoclonal Antibodies Using Agilent Biopharma Analytical Workflow Solutions

Význam tématu

Coformulace monoklonálních protilátek představuje inovativní přístup ve vývoji proteinových bioterapeutik, umožňující současné cílení na více antigenů a zlepšující léčebnou účinnost. Tato strategie klade vyšší nároky na analytickou charakterizaci, protože vzájemná interakce změřených atributů v mísení musí být přesně sledována pro zajištění kvality a bezpečnosti konečného léčiva.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo demonstrovat komplexní analytický pracovní postup pro coformulované monoklonální protilátky založený na řešeních Agilent Biopharma Analytical Workflow. Hlavní zaměření spočívá ve sledování kritických kvalitativních atributů (CQAs), jimiž jsou:

• Heterogenita nabití (charge variants) pomocí kationtově výměnné chromatografie (CEX)
• Obsah agregátů a monomerů pomocí velikostně vylučovací chromatografie (SEC)
• Detailní mapování peptidů a post-translační modifikace (peptide mapping) na LC/ESI-Q-TOF

Použitá metodika a instrumentace

Pro separace byly použity následující chromatografické metody na platformě Agilent 1290 Infinity II bio LC:

• CEX: Agilent Bio Mab NP5 (2,1×250 mm, PEEK), gradient pH 7,0→8,4 ve 30 mM fosfátovém pufru, DAD detekce při 280 nm
• SEC: AdvanceBio SEC 300 Å (7,8×150 mm, 2,7 µm) v 100 mM fosfátovém pufru + 150 mM NaCl, DAD při 280 nm
• Peptide mapping: AdvanceBio peptide mapping (2,1×150 mm, 2,7 µm) s tryptickou digescí, LC/Q-TOF 6545XT, pozitivní AJS ESI

Další vybavení a software:

• Agilent 1290 Infinity II quaternary a binary pump
• Autosampler, multicolumn thermostat, DAD detektor
• MassHunter LC/MS Data Acquisition a BioConfirm

Hlavní výsledky a diskuse

CEX metoda dosáhla vysoké rozlišitelnosti hlavního izoformu od kyselých a bazických variant s RT RSD <0,16 % a area RSD do 9 %. Ve srovnání jednotlivých složek a 1:1 směsi byly profily konzistentní, což potvrzuje schopnost metody identifikovat varianty ve smíšeném vzorku.
SEC analýza ukázala separaci monomeru a agregátů i v koformulované směsi. Přesné vyhodnocení monomeru a agregátů bylo dosaženo s area RSD kolem 3 % a RT RSD pod 2 %.
Peptidové mapování poskytlo sekvenční pokrytí přes 95 % pro obě protilátky i jejich směs. Extrahované iontové chromatogramy CDR peptidů prokázaly přítomnost obou složek. Vyhodnocení PTM odhalilo srovnatelné úrovně oxidace metioninu, deamidace asparaginu a ztráty lyzinu na C-terminu.

Přínosy a praktické využití metody

Integrovaný přístup umožňuje komplexní, vysoce reprodukovatelnou charakterizaci coformulovaných mAb ve vývojových a stabilitních studiích. Workflow podporuje:

• Kontrolu kvalitativních atributů pro QA/QC procesy
• Rychlou identifikaci změn během formulace a výrobního procesu
• Podklady pro regulátorní dokumentaci a schvalování kombinovaných léčiv

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se rozšíření multi-atributních metod kombinujících ultrarychlé chromatografie s vysoce citlivou hmotnostní spektrometrií. Důraz bude kladen na automatizaci, využití umělé inteligence pro analýzu dat a rozvoj nanoflow-LC/MS pro analýzu stopových variant v komplexních směsích.

Závěr

Studie potvrzuje, že Agilent Biopharma Analytical Workflow představuje robustní a flexibilní řešení pro detailní charakterizaci coformulovaných monoklonálních protilátek. Navržené chromatografické a MS techniky poskytují spolehlivá data o CQAs, která jsou klíčová pro vývoj, kontrolu kvality a schvalování nových biologických léčiv.

Reference

• 1. Larbouret C. et al. Improving Biologics’ Effectiveness in Clinical Oncology: From the Combination of Two Monoclonal Antibodies to Oligoclonal Antibody Mixtures. Cancers (Basel) 2021, 13(18), 4620.
• 2. Mouchahoir T.; Schiel J. E. Development of an LC-MS/MS Peptide Mapping Protocol for the NISTmAb. Analytical and Bioanalytical Chemistry 2018, 410, 2111–2126.