Evaluation of Sample Preparation Options for the Simultaneous Extraction of Angiotensin and Aldosterone Prior to UHPLC-MS/MS Analysis

Význam tématu

Současné stanovení angiotensinu I, II a aldosteronu v plazmě je klíčové pro diagnostiku sekundární hypertenze a posouzení poměru aldosteron/renin. Dříve se tyto analýzy prováděly samostatně, což zvyšovalo čas a náklady. Vyvinutí robustní metody pro simultánní extrakci s vysokou citlivostí a reprodukovatelností přináší významné výhody pro klinické i výzkumné laboratoře.

Cíle a přehled studie

Cílem bylo vyhodnotit různé postupy přípravy vzorku pro simultánní extrakci angiotensinů I, II a aldosteronu z lidské plazmy před UHPLC-MS/MS analýzou. Studie zahrnovala:

• optimalizaci sorpční extrakce (SPE) s polymerovými sorbenty ABN, CX a AX,
• vyhodnocení dopadů odpařovacích podmínek a nespecifického vá bindingu k plastům,
• vliv pH, mycích a elučních fází na výtěžnost a čistotu extraktu,
• testování různých protikoagulačních činidel a mobilních fází pro pozit. a negat. ionizaci.

Použitá metodika a instrumentace

Sample preparation:

• Inkubační krok: 250 µL plazmy + 50 µL inkubačního pufru při 37 °C/1 h, reakce ukončena 10 µL 10 % formi­kové kyseliny.
• SPE: 96-well formát s EVOLUTE® EXPRESS ABN, CX, AX (30 mg). Mytí 2% NH4OH a MeOH/H2O; eluce EtOAc (+IPA pro CX) a MeOH/EtOAc směsi.
• Odpaření při 40 °C, rekonstituce v 200 µL 0,2 % kyseliny octové (50:50 H2O:MeOH).

UHPLC-MS/MS:

• UHPLC: Shimadzu Nexera, kolona ACE EXCEL C18 (1,7 µm, 50×2,1 mm), mobile fáze A: 0,2 mM NH4F ve vodě, B: MeOH, gradient 60–20 % A.
• MS/MS: Shimadzu 8060 triple-quad, ESI v pozitivním i negativním modu, MRM přechody optimalizovány pro každý analýt (Tab. MRM).

Hlavní výsledky a diskuse

Evaporační studie ukázaly významné nespecifické vá bindingy k plastům, ovlivňující angiotensiny více než steroidy. Optimalizace pH umožnila frakcionaci analýtů: angiotensin eluce při vyšším pH, aldosteron při nižším. EtOAc vykázala nejlepší eluci pro ABN, CX potřeboval přídavek 2 % IPA. Čistota extraktů (odstranění fosfolipidů) byla podstatně vyšší u optimalizovaných protokolů SPE než při jednoduché precipitaci proteinů. Protokoly ABN i CX dosáhly výtěžností >80 %, LOQ pod 10 pg/mL a lineárních koeficient r2 > 0,999.

Přínosy a praktické využití metody

• Unified workflow pro simultánní stanovení peptidů a steroidů šetří čas i náklady.
• Vysoká citlivost a specifita umožňuje spolehlivé detekce nízkých úrovní v klinických vzorcích.
• Minimalizace matrice a fosfolipidových interferencí zajišťuje stabilní kvantifikaci.
• Protokoly jsou snadno implementovatelné v rutinní laboratorní praxi.

Budoucí trendy a možnosti využití

Další rozvoj lze zaměřit na automatizaci SPE v online režimu, miniaturizaci sorpčních formátů a šíření metodiky na další kardiovaskulární biomarkery. Integrace strojového učení pro optimalizaci postupů přípravy vzorku a chromatografie může dále zlepšit výkon a robustnost analýz.

Závěr

Studie prokázala, že optimalizované SPE protokoly s sorbenty ABN a CX jsou vhodné pro simultánní extrakci angiotensinu I, II a aldosteronu, poskytují vynikající výtěžnosti, LOQ a linearitu. Navržený postup přináší robustní a efektivní řešení pro klinickou a výzkumnou analýzu.

Reference

• Katie-Jo Teehan et al., Evaluation of Sample Preparation Options for the Simultaneous Extraction of Angiotensin and Aldosterone Prior to UHPLC-MS/MS Analysis, MSACL EU 2018.