Native ion exchange chromatography directly coupled to Orbitrap mass spectrometry allows surface charge discrimination and online detection of intact proteins

Význam tématu

Analýza intact proteinů podmínek blízkých fyziologickému prostředí je klíčová pro charakterizaci terapeutických protilátek a dalších biofarmaceutik. Kombinace iontové výměnné chromatografie za „native“ podmínek s Orbitrapovou hmotnostní spektrometrií přináší možnost diskriminace proteinů podle povrchového náboje při zachování jejich terciární struktury, vysokého rozlišení a přesnosti hmotnosti.

Cíle a přehled studie

Hlavním cílem bylo demonstrovat integrovanou platformu pro přímé propojení slabě kationtové výměnné chromatografie (WCX) v nativních podmínkách s Q Exactive HF-X Orbitrap MS pro analýzu intact protilátek. Studie se soustředila na separaci a online detekci hlavních a variantních nabitých forem terapeutické monoklonální protilátky Trastuzumab.

Použitá metodika a instrumentace

Pro separaci byl použit sloupec ProPac WCX-10 (4×250 mm) na systému Vanquish Horizon UHPLC. Mobilní fáze sestávala z volatilního amonné octanu (50 mM) při pH ≈7 (Buffer A) a pH ≈10 (Buffer B) s lineárním pH elucním gradientem 1–8 % B během 20 minut. Kolona zajišťuje on-line koncentrování a odsolení vzorku. Eluat plynule přecházel do zdroje ESI Q Exactive HF-X Orbitrapu v režimu High Mass Range. Pro peptide mapping byla použita Orbitrap Elite s DDA CID MS/MS. Data intact proteinů byla vyhodnocena v softwaru BioPharma Finder 2.0 pomocí algoritmů ReSpect a Sliding Window.

Hlavní výsledky a diskuse

• Rozlišení hlavní formy a singly deamidované varianty Trastuzumabu s časovým odstupem několika minut.
• Generování „native“ masových spekter s nižšími náboji a vyšším m/z, což minimalizuje vzájemné rušení signálů.
• Automatická detekce a dekonvoluce tří nejhojnějších glykoform a jejich deamidovaných ekvivalentů s chybou <4 ppm.
• Potvrzení míst deamidace (reziduum D30 lehkého řetězce) metodou frakcionace WCX a následným peptide mappingem.
• Demonstrace univerzálnosti metodiky na dalších komerčních monoklonálních protilátkách, včetně separace C-terminálních lyzino-vrstev.

Přínosy a praktické využití metody

• Rychlá on-line analýza intact proteinů bez nutnosti separátního desaltingu.
• Vysoká selektivita pro blízce příbuzné, téměř izobarické varianty na základě povrchového náboje.
• Zachování terciární struktury přináší jednodušší spektrální obraz a lepší přesnost měřených hmotností.
• Možnost implementace do BioPharma QA/QC pro charakterizaci terapeutických protilátek.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření aplikace na jiné třídy kationických proteinů, včetně enzymů a konjugátů.
• Integrace s iontovým mobilitním spektrometrem pro další dimenzi separace.
• Optimalizace pro zvýšení rychlosti analýzy a kapacity kolony.
• Vývoj databází nativních nabitých variant pro podporu automatizované identifikace.

Závěr

Native WCX-MS platforma spojuje výhody iontové výměnné chromatografie pod fyziologickými podmínkami s vysokým rozlišením Orbitrapové MS. Metoda nabízí selektivní separaci a přesnou hmotnost intact proteinů, což umožňuje detekci jemných modifikací, jako je deamidace nebo variace C-terminálních lyzinů. Tento přístup má široké uplatnění ve výzkumu, vývoji i výrobě biofarmaceutik.

Reference

1. Marcoux J, Champion T, Colas O, Wagner-Rousset E, Corvaïa N, Van Dorsselaer A, Beck A, Cianférani S. Native mass spectrometry and ion mobility characterization of trastuzumab-emtansine, a lysine-linked antibody drug conjugate. Protein Sci. 2015;24(8):1210–1223.
2. Harris RJ, Kabakoff B, Macchi FD, Shen FJ, Kwong M, Andya JD, Shire SJ, Bjork N, Totpal K, Chen AB. Identification of multiple sources of charge heterogeneity in a recombinant antibody. J Chromatogr B Biomed Sci Appl. 2001;752(2):233–245.