Enhanced Metabolite Identification Using Orbitrap Tribrid Mass Spectrometer

Význam tématu

Identifikace metabolit je klíčová v průběhu vývoje léčiv pro pochopení farmakokinetiky a bezpečnosti sloučenin. High resolution mass spectrometry (HRMS) umožňuje detailní analýzu metabolické biotransformace i v komplexních matricích, kde tradiční DDA (data-dependent acquisition) může selhávat v důsledku rušivých iontů z pozadí. Workflow AcquireX zvyšuje kvalitu MSn dat díky automatickému generování inkluzních a exkluzních seznamů a inteligentnímu rozhodování v reálném čase při získávání dat.

Cíle a přehled studie

Studie zjistila, jaký přínos má použití AcquireX background exclusion workflow na Orbitrap ID-X Tribrid MS v porovnání s klasickou DDA metodou pro identifikaci metabolit pěti modelových léčiv (Amprenavir, Bosentan, Lopinavir, Tipranavir, Ritonavir) ve vzorcích žluči a lidské plazmy při koncentracích 0,1–5 μM. Cílem bylo zvýšit počet spouštěných MSn spekter a tím odhalit více známých i neočekávaných metabolitů.

Použitá metodika a instrumentace

Analýza proběhla technikou UHPLC-HRMS s workflow AcquireX:

• Orbitrap ID-X Tribrid MS (Thermo Fisher Scientific) s electrospray ionizací v pozitivním módu, rozlišení 120 000 (full scan) a 30 000 (MS/MS), stepped HCD CE 20/40/60 %
• Thermo Vanquish Flex UHPLC systém s binary pumpou, autosamplerem, column compartment a DAD
• Kolona Thermo Hypersil C18 (100 × 2,1 mm, 1,9 µm) při 45 °C, mobilní fáze A: H2O/0,1 % FA, B: ACN/0,1 % FA, gradient 5–70 % B
• Flow rate 400 µl/min, injekční objem 10 µl
• Software Compound Discoverer 3.0 a Mass Frontier 8.0 pro dekonvoluci, anotace FISh a generování biotransformačních seznamů

Hlavní výsledky a diskuse

Workflow AcquireX významně snížil vliv biologického pozadí a zajistil vyvolání MSn pro všechny cílové sloučeniny, zatímco DDA selhávala u některých z nich. Celkem bylo identifikováno osm metabolitů pomocí AcquireX oproti šesti s DDA. FISh fragmentace umožnila lokalizovat místa biotransformace a odhalit neočekávané produkty. Výsledky potvrzují schopnost AcquireX automaticky generovat inkluzní/exkluzní seznamy a optimalizovat sběr dat v komplexních matricích.

Přínosy a praktické využití metody

AcquireX workflow se osvědčil pro rychlou a efektivní identifikaci nízkokoncentrovaných metabolitů v biologických vzorcích. Metoda minimalizuje rušivé signály, zvyšuje počet kvalitních MSn spekter a zkracuje dobu analýzy. Díky tomu je vhodná pro farmaceutický výzkum, QA/QC a průmyslovou metabolomiku.

Budoucí trendy a možnosti využití

Dalším krokem je integrace strojového učení pro predikci vhodných inkluzních seznamů, rozšíření workflowu na ion mobility-MS, vysokoprůtokové screeningové studie a aplikace v endogenní metabolomice s recyklací biotransformačních dat pro vyšší automatizaci.

Závěr

Orbitrap ID-X Tribrid MS ve spojení s AcquireX background exclusion workflow výrazně zlepšuje počet a kvalitu MSn spekter pro identifikaci metabolit ve složitých vzorcích. Kombinace s nástroji Compound Discoverer 3.0 a Mass Frontier 8.0 nabízí komplexní řešení pro confidentní strukturální charakterizaci metabolit.