Large Scale Targeted Protein Quantification Using WiSIM-DIA Workflow on a Orbitrap Fusion Tribrid Mass Spectrometer

Význam tématu

Masová kvantifikace proteinů je klíčová v proteomice, umožňuje zkoumání expresních hladin v komplexních vzorcích. Data-independent acquisition (DIA) rozšiřuje možnosti vysokopropustné a přesné analýzy, zatímco WiSIM-DIA workflow kombinuje vysoké rozlišení SIM skenů a CID MS/MS pro současnou kvantifikaci a potvrzení sekvence.

Cíle a přehled studie

Studie hodnotí výkonnost WiSIM-DIA na přístroji Orbitrap Fusion Tribrid pro velkoobjemové cílené kvantifikace proteinů. Cílem bylo potvrdit reprodukovatelnost, citlivost a přesnost kvantifikace tisíců peptidů v různých vzorcích včetně E. coli digestů a imunoprecipitovaných cílů z buněčných lyzátů.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky:

• E. coli digesty při koncentracích 250, 500 a 1000 ng/µL
• IP-enriched vzorky A431 lyzátů s cíli EGFR, AKT1/2, PTEN

Chromatografie:

• EASY-nLC 1000 s PepMap C18 kolónou 75 µm × 50 cm
• Gradientní eluce 5–35 % acetonitrilu v 120 min při 300 nL/min

Hmotnostní spektrometrie:

• Orbitrap Fusion Tribrid s EASY-Spray zdrojem
• 3× HRAM SIM skeny (240 000 FWHM, 200 amu okna) paralelně s 17× CID MS/MS (12 amu okna)

Data processing:

• Pinpoint 1.4 pro cílenou extrakci kvantitativních signálů
• Proteome Discoverer se SEQUEST HT pro generaci spektrální knihovny (FDR 1 % striktní, 5 % relaxované)

Hlavní výsledky a diskuse

• Z 1 100 cílených proteinů E. coli bylo kvantifikováno 1 090 (98 % úspěšnost).
• Přesnost kvantifikace pro dvounásobné změny byla > 97 %; 85 % peptidů mělo %CV < 15 %.
• Imunoprecipitace A431 lyzátu vedla k > 20násobnému obohacení vybraných proteinů (např. AKT2).

Přínosy a praktické využití metody

• Kombinace vysokého rozlišení SIM a CID MS/MS umožňuje spolehlivou a citlivou kvantifikaci velkého počtu proteinů.
• Metoda je vhodná pro výzkumné aplikace, QA/QC a klinické studie biomarkerů.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření spektrálních knihoven a automatizace workflow.
• Integrace s dalšími kvantitativními přístupy (SRM/MRM, PRM).
• Využití ve studiu dynamiky posttranslačních modifikací a multiplexních analýzách.

Závěr

WiSIM-DIA na Orbitrap Fusion Tribrid nabízí vysoce přesnou a reprodukovatelnou kvantifikaci tisíců proteinů v jednom běhu. Workflow je flexibilní, škálovatelné a vhodné pro široký rozsah biologických a klinických aplikací.

Reference

• Kiyonami R. et al. Thermo Scientific Application Note AN64026.
• Prakash A. et al. J. Proteome Res. 2009, 8, 2733–2739.
• Patel B. et al. ASMS 2014, Poster 514.