Large Scale Targeted Protein Quantification Using HR/AM Selected Ion Monitoring with MS/MS Confirmation on the Orbitrap Fusion Tribrid MS

Význam tématu

Precizní kvantifikace cílených proteinů v komplexních biologických vzorcích je zásadní pro výzkum, klinickou diagnostiku i průmyslovou kontrolu kvality. Moderní hmotnostní spektrometrie nabízí silné nástroje, avšak zvyšující se složitost matric vyžaduje metody kombinující vysokou selektivitu, citlivost a schopnost potvrzení identity analyzovaných peptidů.

Cíle a přehled studie

Studie představuje novou datově nezávislou akviziční metodiku (DIA), která integruje vysokorozlišovací selektivní iontový monitoring (HR/AM SIM) s paralelními MS/MS analýzami na Orbitrap Fusion Tribrid MS. Cílem je dosáhnout nízkých hladin detekce, širokého dynamického rozsahu a současného potvrzení sekvence peptidů v jednom analytickém běhu.

Použitá metodika a instrumentace

Byl využit přístroj Thermo Scientific™ Orbitrap Fusion™ Tribrid MS spojený s nano-LC systémem EASY-nLC™ 1000 a kolonkou PepMap C18 (75 μm x 50 cm, 2 μm částice). Gradient 5–25 % organiky (0,1 % FA/ACN) probíhal 100 minut, poté 25–35 % během 20 minut. Podmínky MS:

• FT SIM: rozlišení 240 000, AGC target 2e4, izolace 200 amu
• CID MS/MS: rychlá kolizní indukce, izolace 12 amu, AGC target 1e4
• Zdroj: EASY-Spray™, 275 °C, 1 800 V
• Cyklus: 3× SIM skeny (400–600, 600–800, 800–1000 m/z) s následnými 17 sekvenčními MS/MS

Data z SIM skenů slouží pro kvantifikaci, fragmentační data pro post-acviziční potvrzení peptidů pomocí knihovny.

Hlavní výsledky a diskuse

Limity detekce a linearita:

• Sensitivita dosáhla LOD ~10 amol na kolonce
• Lineární dynamický rozsah ~4 řády pro isotopicky značené játrové peptidy

Ve modelové studii se šesti bovinními proteiny ve 500 ng E. coli pozadí bylo dosaženo:

• Detekce a kvantifikace šesti proteinů v rozpětí 10 amol – 1 pmol
• 5 řádů dynamického rozsahu
• 90 % peptidů s CV < 10 %

Paralelní analýza datových souborů umožnila kvantifikovat také 172 proteinů E. coli (771 peptidů) s 69 % peptidů CV < 10 % a 88 % CV < 15 %.

Přínosy a praktické využití metody

Nová DIA workflow poskytuje:

• Vysokou selektivitu díky HR/AM SIM (240 000)
• Citlivost s LOD v řádu attomol
• Současné potvrzení identity analýzou fragmentů
• Rychlý cyklus (~3,6 s) a vysokou propustnost

Tuto metodu lze uplatnit v proteomických studiích biomarkerů, farmaceutickém vývoji a QA/QC analýzách.

Budoucí trendy a možnosti využití

Další rozšíření přístupu může zahrnovat:

• Automatizované vytváření a rozšiřování spektrálních knihoven
• Integraci s výpočetními nástroji pro hloubkovou statistickou analýzu
• Adaptaci na další třídy biomolekul (metabolity, lipidy)
• Vyšší paralelizaci i vyšší rozlišení pro komplexní matrice

Závěr

Popsaná DIA metoda spojuje vysoce rozlišovací SIM a paralelní MS/MS analýzu, čímž zajišťuje citlivou a selektivní kvantifikaci cílených peptidů s potvrzením identity. Výsledky ukazují LOD ~10 amol, >4 řády linearity a výbornou reprodukovatelnost, což potvrzuje použitelnost v pokročilých proteomických aplikacích.

Reference

1. Gillet LC, Navarro P, Tate S, Roest H, Selevsek N, Reiter L, Bonner R, Aebersold R. Targeted data extraction of the MS/MS spectra generated by data independent acquisition: a new concept for consistent and accurate proteome analysis. Mol Cell Proteomics. 2012;11(O111.016717).
2. Egertson JD, Kuehn A, Merrihew G, Bateman N, MacLean B, Ting YS, Canterbury JD, Kellmann M, Zabrouskov V, Wu C, MacCoss MJ. Multiplexed Data Independent Acquisition for Comparative Proteomics. ASMS Poster 2012.
3. Gallien S, Duriez E, Demeure K, Domon B. Selectivity of LC-MS/MS analysis: Implication for proteomics experiments. J Proteomics. 2013;81:148–158.