Quantitation of 25-Hydroxyvitamin D2 and 25-Hydroxyvitamin D3 in Plasma for Clinical Research Using the Prelude SPLC and TSQ Endura Mass Spectrometer

Význam tématu

Vitamin D je klíčový hormon regulující metabolismus vápníku a imunitní funkce. Stanovení cirkulujících metabolitů 25-hydroxyvitamin D2 a D3 je zásadní pro hodnocení nutričního stavu a rizika onemocnění kosterního i imunitního systému. Rychlé, spolehlivé a vysoce propustné analytické metody proto nacházejí široké uplatnění v klinickém výzkumu a diagnostice.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo ověřit výkonnost systému Prelude SPLC ve spojení s TSQ Endura triple kvadrupolovým hmotnostním spektrometrem pro kvantitativní analýzu 25OH D2 a 25OH D3 v lidské plasmě. Studie hodnotila linearitu, limity kvantifikace, přesnost, preciznost, zotavení analytů a vliv matrice.

Použitá metodika a instrumentace

Sample preparation:

• Proteinová precipitace: 100 µL plazmy + 200 µL metanolu s interním standardem (d6-25OH D3).
• Vortex, centrifugace, injekce 100 µL supernatantu.

Chromatografie:

• Online čištění: Thermo Scientific Cyclone-P (0,5×50 mm) s TurboFlow technologií.
• Separace: Thermo Scientific Accucore aQ (2,1×100 mm, 2,6 µm), teplota 25 °C, doba analýzy 5 minut.

Hmotnostní spektrometrie:

• TSQ Endura s APCI zdrojem.
• Režim SRM (selected-reaction monitoring).

Software:

• Data acquisition a zpracování: Thermo Scientific TraceFinder.

Hlavní výsledky a diskuse

Limity kvantifikace (LOQ) obou analytů byly 4 ng/mL. Linearita metody byla pro koncentrace 4–200 ng/mL. Inter-denní preciznost (RSD) byla lépe než 5,1 % pro 25OH D2 a 6,6 % pro 25OH D3. Recovery se pohybovala v rozmezí 107–132 % (25OH D2) a 102–118 % (25OH D3). Absolutní vliv matrice činil 62–79 %, relativní vliv po korekci interním standardem dosáhl 76–89 % pro D2 a 98–116 % pro D3. Analýza standardů NIST potvrdila přesnost 93–107 %. Výsledky ukazují, že použití deuterovaných standardů účinně potlačuje matriční interferenci.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda kombinuje automatizované online čištění a paralelní dvoukanálový provoz, což zvyšuje propustnost až na 24 vzorků za hodinu a minimalizuje manuální zásahy. Vysoká robustnost a spolehlivost ji předurčují pro klinické výzkumné laboratoře, populační studie a rutinní QA/QC.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Multiplexní stanovení dalších vitamínových nebo lipidových metabolitů.
• Implementace vysoce propustných platforem s cílem zkrátit dobu analýzy.
• Integrace výsledků do klinických rozhodovacích podpoří personalizaci léčebných postupů.
• Vývoj menších, přenosných zařízení pro polní nebo point-of-care testování.

Závěr

Předložená metoda analýzy 25-hydroxyvitaminů D2 a D3 poskytuje rychlé, přesné a robustní řešení splňující nároky klinického výzkumu. Vysoká propustnost, minimální vliv matrice a jednoduchá příprava vzorku posouvají standardy laboratorní praxe.

Reference

• Xie X., Kozak M. Quantitation of 25-Hydroxyvitamin D2 and 25-Hydroxyvitamin D3 in Plasma for Clinical Research Using the Prelude SPLC and TSQ Endura Mass Spectrometer. Application Note No. 659, Thermo Fisher Scientific, 2016.