Determination of inborn errors of metabolism

Význam tématu

Newborn screening představuje zásadní veřejný zdravotní program pro včasnou detekci dědičných metabolických poruch. Profilování aminokyselin a acylkarnitin z suchých krevních skvrn (DBS) umožňuje rychlou a citlivou analýzu širokého spektra metabolitů. Moderní metody MS/MS navíc minimalizují falešně pozitivní výsledky a usnadňují rozšíření screeningových parametrů bez nutnosti derivatizace vzorku.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo zavedení a validace rychlého protokolu flow injection analysis–tandemové hmotnostní spektrometrie (FIA-MS/MS) pro simultánní kvantifikaci 13 aminokyselin a 13 acylkarnitin v DBS určené k výzkumu vrozených metabolických poruch. Metoda byla implementována na platformě Thermo Scientific Vanquish Flex UHPLC a TSQ Fortis QqQ MS.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky: 3,2mm průstřely DBS.
Extrakce: chromsystems extrakční činidlo obsahující izotopově značené interní standardy.
Proces: přidání 100 µl extrakčního činidla, inkubace při 600 rpm po dobu 20 minut, separace extraktu.
Analýza: flow injection analysis na Vanquish Flex Binary UHPLC, objem injekce 10 µl, běhová doba 1,5 minuty.
Detekce: Thermo Scientific TSQ Fortis QqQ se zdrojem HESI v režimu SRM.

• Vysoké napětí: 3500 V
• Vaporizační teplota: 150 °C, kapilární teplota: 300 °C
• Tlak kolizního plynu: 1,5 mTorr
• Rozlišení Q1/Q3: 0,7 FWHM

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda prokázala vysokou přesnost a robustnost:

• Intra-assay přesnost (%CV) pro většinu analytů < 9 %, inter-assay přesnost < 12,5 %
• Acylkarnitin C5DC dosáhl mírně vyšších hodnot variability (intra 14,9 %, inter 17,7 %)
• Relativní přesnost (bias) všech analytů v rozmezí –12,8 % až +11,8 %

Rychlý průběh analýzy (< 2 minuty) bez chromatografické separace významně zkracuje dobu mezi odběrem vzorku a výsledkem, což je kritické zejména u vyšetření novorozenců s podezřením na akutní metabolickou dekompenzaci.

Přínosy a praktické využití metody

Metodika umožňuje:

• Vysokopropustné screeningové vyšetření DBS
• Minimální objem vzorku a bez potřeby derivatizace
• Současné stanovení aminokyselin i acylkarnitin
• Využití komerční sady MassChrom pro standardizaci a kvalitu výsledků

Budoucí trendy a možnosti využití

Další rozvoj může směřovat k:

• Automatizaci přípravy vzorků a integraci s robotickými systémy
• Rozšíření panelu analyzovaných metabolit o biogenní aminy či organické kyseliny
• Využití strojového učení pro selekci markerů a predikci metabolických poruch
• Přenosným MS/MS systémům pro terénní screening a urgentní diagnózu

Závěr

Zavedená FIA-MS/MS metoda na platformě TSQ Fortis dosahuje požadované citlivosti, přesnosti a reprodukovatelnosti pro kvantifikaci aminokyselin a acylkarnitin z DBS. Díky rychlému vyhodnocení a robustnímu přístupu je vhodná pro klinický výzkum i vysoce propustné screeningové programy.

Reference

• Lemonde H. Pediatr. Child Health, 2014, 25, 103–107.
• Marca G. J. Pharm. Biomed. Anal., 2014, 101, 174–182.
• Lund A. M. Mol. Genet. Metab., 2012, 107, 281–293.
• Sandlers Y. Transl. Res., 2017, 189, 65–75.