Extraction of Catecholamines and Metanephrines from Human Plasma Biotage® Extrahera™ LV-200 and Low Volume SPE Prior to UHPLC-MS/MS Analysis

Význam tématu

Analýza katecholaminů a jejich metabolitů v lidské plasmě je klíčová pro diagnostiku a sledování různých onemocnění, včetně feochromocytomu, srdečně-cévních poruch a neurologických onemocnění. Spolehlivá extrakce a kvantifikace těchto sloučenin při nízkých koncentracích je nezbytná pro přesné klinické rozhodování.

Cíle a přehled studie

Tento dokument popisuje vývoj a validaci postupu pro extrakci šesti katecholaminů (norepinefrin, epinefrin, dopamin) a tří metanephrinů (normetanephrin, metanephrin, 3-methoxytyramin) z lidské plazmy před analýzou UHPLC-MS/MS. Studie porovnává manuální zpracování na panelech Biotage PRESSURE+ 96 a automatizované zpracování na Biotage Extrahera LV-200.

Použitá metodika a instrumentace

Metoda vychází z mixed-mode SPE s použitím sloučenin se slabou kationtovou výměnou (EVOLUTE EXPRESS WCX 10 mg). Klíčové kroky:

• Předúprava: centrifugace plazmy, přidání deuterovaných interních standardů a pufru (10 mM Na-citrát, pH 7).
• Podmínění: methanol a 10 mM ammonium acetát pH 6.
• Naložení vzorku a tří fáze promývání (vodný pufr, 80:20 MeOH:H2O, dichlormethan) s odsátím a sušením.
• Eluce: 85:15 H2O:isopropanol s 0,1 % formiátové kyseliny, následné odpaření a rekonstituce do 95:5 H2O:MeOH s 0,1 % formiátové kyseliny.

Instrumentace:

• SPE: EVOLUTE EXPRESS WCX 10 mg p/n 602-0010-PX01; Biotage PRESSURE+ 96 manuální
• Automatizace: Biotage Extrahera LV-200
• UHPLC: Shimadzu Nexera s kolonkou Avantor ACE Excel 1.7 µm C18-PFP (100×3,0 mm) + RESTEK Raptor ARC-18 guard
• MS/MS: AB SCIEX Triple Quad 5500 s Turbo-IonSpray v pozitivním módu

Hlavní výsledky a diskuse

Při 200 µL plasmatu a 10 µL interních standardů byla dosažena extrakční návratnost 65–82 % (RSD < 11 %) pro všechny analyty. Linearity v rozsahu 10–500 pg/mL (r²>0,995) s LOQ mezi 1–20 pg/mL v závislosti na sloučenině. Matrixové faktory ukazují minimální potlačení signálu (signal factor > 0,7). Automati­zace na Extrahera LV-200 poskytuje obdobné výsledky jako manuální postup s celkovým časem zpracování 96 vzorků ~60 min (bez odpaření).

Přínosy a praktické využití metody

• Vysoká citlivost a reprodukovatelnost kvantifikace katecholaminů na úrovni biologických referenčních intervalů.
• Minimalizace ruční práce a variability díky SPE automatizaci.
• Robustní odstraňování matrice a snížená frekvence údržby chromatografického systému.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se širší implementace online SPE-UHPLC-MS/MS systémů, další miniaturizace objemů vzorku a používání nových nosičů pro zlepšení selektivity a rychlosti analýzy. Integrace do klinických automatizovaných platforem umožní vyšší kapacitu a standardizaci.

Závěr

Popisovaná metoda nabízí spolehlivou a automatizovanou extrakci katecholaminů a metanephrinu z lidské plazmy s vysokou obnovou, nízkými LOQ a minimálními matrixovými efekty. Automatizace pomocí Biotage Extrahera LV-200 výrazně zvyšuje produktivitu bez kompromisů v analytické kvalitě.

Použitá instrumentace

• Biotage Extrahera LV-200
• EVOLUTE EXPRESS WCX 10 mg SPE panele
• Shimadzu Nexera UHPLC, Avantor ACE Excel C18-PFP kolonka
• AB SCIEX Triple Quad 5500 MS/MS s Turbo-IonSpray