Targeted metabolomics method using IC Orbitrap with high resolution mass spectrometry

Význam tématu

Metabolická analýza vysoce polárních a aniontových látek je klíčová pro pochopení životních procesů, jako jsou glykolýza, pentózový fosfátový cyklus, citrátový cyklus nebo metabolismus nukleových kyselin. Přesná kvantifikace a profilování těchto látek přispívá k odhalení regulačních mechanismů a diagnostice onemocnění.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo vyvinout univerzální cílenou metabolomickou metodu spojující iontovou chromatografii (IC) s vysokým rozlišením Orbitrapové hmotnostní spektrometrie (Q Exactive). Metoda má umožnit analýzu více než 350 vodou rozpustných metabolitů, včetně silně polárních aniontů, a optimalizovat přípravu vzorků z buněčných kultur a lidské séra.

Použitá metodika a instrumentace

Pro separaci aniontů byla použita iontovýměnná kolona Thermo Scientific Dionex IonPac AS11-HC-4μm s elucí gradientem nevolatilního KOH (10–100 mM) generovaného eluentním generátorem EGC 500. Po separaci odstraňuje elektrolyticky regenerovaný potlačovač AERS 500e zbylé soli a přivádí vodu do MS. Analyt detekuje Thermo Scientific Q Exactive s režimy ESI v kladném i záporném ionizačním módu, rozlišením 70 000 pro Full MS a 17 500 pro daty řízené MS/MS.

Použitá instrumentace

• IC systém Dionex ICS-5000+ HPIC
• Iontoměnná kolona IonPac AS11-HC-4 µm a ochranná kolona AS11HC-9 µm
• Eluentní generátor Dionex EGC 500 (KOH)
• Potlačovač AERS 500e
• MS detektor Thermo Scientific Q Exactive Orbitrap

Hlavní výsledky a diskuse

Metodu validovali na 600 standardních metabolitech a v databázi TraceFinder bylo registrováno 359 eliminovaných iontů (264 v kladném módu, 336 v záporném). Metoda exceluje separací silně polárních aniontů, včetně koenzymů (ATP, NAD+, NADH, CoA) a isomerů cukerných fosfátů, zajišťuje ostré tvary píků bez adheze na kovové části. Analýza HeLa buněk odhalila citlivou kvantifikaci sekundárních poslů (cAMP) a vysokou reprodukovatelnost retenčních časů a plošných integrál.

Přínosy a praktické využití metody

• Rozšířený rozsah měřitelných aniontových metabolitů
• Vysoká citlivost a přesnost (< 5 ppm) díky HRAM
• Možnost analýzy vzorků s nevolatilními solemi po potlačení
• Vysoká reprodukovatelnost a robustnost analýzy

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se rozšíření knihoven o další biomolekuly, integrace s datovými platformami pro rychlou identifikaci a kvantifikaci a aplikace v klinické diagnostice, farmaceutickém výzkumu a personalizované medicíně. Vývoj automatizovaných pracovních postupů a hybridních separačních technik může dále zvýšit rozsah a citlivost analýz.

Závěr

Metoda IC-Orbitrap kombinuje vysoké rozlišení chromatografie a hmotnostní spektrometrie, přináší komplexní a citlivou analýzu více než 350 polárních metabolitů. Díky potlačovači soli a optimalizované přípravě vzorků umožňuje spolehlivou práci se složitými biologickými matricemi a nabízí perspektivu revolučního nástroje v oblasti metabolomiky.

Reference

1. Harada K et al., J. Biosci. Bioeng. 105:249–260 (2008)
2. Hasunuma T et al., J. Exp. Bot. 64:2943–2954 (2013)
3. Kato H et al., J. Biosci. Bioeng. 113:665–673 (2013)
4. Wang J et al., Anal. Chem. 86:5116–5124 (2014)
5. Buscher JM et al., Anal. Chem. 81:2135–2143 (2009)