Pathway-Targeted Metabolomic Analysis in Oral/Head and Neck Cancer Cells Using Ion Chromatography-Mass Spectrometry

Význam tématu

Metabolomika se zabývá komplexním měřením malých molekul v buňce, jejichž hladiny odrážejí fyziologické a patologické stavy. Cílené zaměření na intermediáty trikarboxylové kyseliny (TCA) je zásadní pro pochopení energetického metabolismu nádorových buněk hlavy a krku, včetně odlišností mezi kmenovými buňkami a buňkami ne-stem-like.

Cíle a přehled studie / článku

Hlavním cílem bylo ukázat, že vysokotlaká iontová chromatografie (HPIC) spojená s vysokým rozlišením a přesnou hmotností na přístroji Q Exactive HF umožňuje rychlou, citlivou a robustní kvantifikaci záměrně cílených metabolitů, zejména TCA cyklu, a potvrdit dřívější poznatky pomocí globálního profilu získaného metodou CapIC-MS.

Použitá metodika a instrumentace

Odběr buněk zahrnoval kultivaci čtyř řad buněk rakoviny hlavy a krku (UM1, UM2, UMSCC5, UMSCC6) a izolaci kmenových buněk metodou spherogenního testu. Extrakce metabolitů proběhla snap-frezováním v kapalném dusíku a extrakcí metanol−voda.

Použitá instrumentace

• Thermo Scientific Dionex ICS-5000+ HPIC s AERS 500 suppressorem
• Kolona Dionex IonPac AS11-HC 2×250 mm, 4 µm
• Thermo Scientific Q Exactive HF hybridní kvadrupól-Orbitrap
• Elektrospray v záporném režimu, m/z 67–1000, rozlišení 120000
• Software: TraceFinder 3.2 a SIEVE 2.2

Hlavní výsledky a diskuse

Optimalizace HPIC umožnila průtok 380 µL/min a dobu separace 20 min s mimořádnou reprodukovatelností (<±0,03 min RT) a nízkou variabilitou (<10% CV) přes 150 injekcí. Šestiřádová řada stabilně označených standardů dosáhla pěti řádů dynamického rozsahu (0,1–10000 pg/µL, R2 ≥ 0,99). Kvantifikace endogenních metabolitů ukázala, že invazivní buňky UM1 mají vyšší hladiny TCA intermediátů než UM2 a podobně UMSCC5 výrazně převyšovaly UMSCC6. Rozdíly mezi kmenovými a ne-stem-like buňkami potvrdily předchozí pozorování: první polocyklus (pyruvát/citrát/α-ketoglutarát) byl v kmenových buňkách zvýšen, zatímco druhá polovina (sukcinát/fumarát/malát) byla snížena.

Přínosy a praktické využití metody

• Rychlá a robustní analýza s vysokou propustností až stovek vzorků
• Vysoká selektivita pro polarické a izobarické metabolity
• Možnost simultánního cíleného a globálního sledování metabolomu z jedné injekce
• Vynikající citlivost na nízké hladiny metabolitů (fmol–nmol)
• Interní standardy minimalizují matriční efekty a zajišťují přesné kvantifikace

Budoucí trendy a možnosti využití

Platforma HPIC-Orbitrap je perspektivní pro rozšíření na další metabolické dráhy a větší sady vzorků v preklinickém i klinickém výzkumu. Dalšími kroky jsou integrace s fluxovou analýzou pomocí izotopové sledovací techniky, automatizace přípravy vzorků a kombinace s pokročilými nástroji strojového učení pro objevování biomarkerů.

Závěr

Společné použití vysokotlaké iontové chromatografie a vysokorozlišovacího Orbitrap MS umožňuje rychlou, přesnou a věrohodnou kvantifikaci cílených metabolitů trikarboxylové kyseliny v buňkách rakoviny hlavy a krku. Metoda potvrzuje dřívější poznatky o rozdílech mezi kmenovými a ne-stem-like buňkami a nabízí robustní nástroj pro rozsáhlé metabolomické studie.

Reference

1. Roberts LD, et al. Targeted metabolomics. Curr Protoc Mol Biol. 2012;C30:U30.2.1‐24.
2. Kuehnbaum NL, et al. New advances in separation science for metabolomics. Chem Rev. 2013;113:2437–2468.
3. Soga T. Capillary electrophoresis‐mass spectrometry for metabolomics. Methods Mol Biol. 2007;358:129–137.
4. O’Hagan S, et al. Closed-loop multiobjective optimization of 2D GC/MS. Anal Chem. 2007;79:464–476.
5. Forcisi S, et al. LC–MS in metabolomics: Mass analyzers in UHPLC. J Chrom A. 2013;1292:51–65.
6. Weiss J, ed. Handbook of Ion Chromatography. 3rd ed. 2004:15–25.
7. Bruggink C, et al. Analysis of carbohydrates by IC–MS. J Chrom A. 2005;1085:104–109.
8. Burgess K, et al. Semi-targeted analysis by capillary IC–HRMS. Rapid Commun Mass Spectrom. 2011;25:3447–3452.
9. Wang J, et al. Optimizing MS detection for IC analysis. Rapid Commun Mass Spectrom. 2009;23:3439–3447.
10. Wang J, Christison T, Backiel K, et al. Metabolomic profiling by CapIC–Orbitrap MS. Anal Chem. 2014;86:5116–5124.