Improved Metabolomic Analysis Using an Iron-Free Flow Path

Význam tématu

Metabolomika umožňuje sledovat soubor malých molekul v buňkách jako klíčový indikátor fyziologického stavu. Kvalitní LC/MS analýza je základní technikou, avšak běžné systémy se ocelovou cestou trpí adsorpcí a špatným tvarem píků pro fosforylované metabolity. Zavedení biokompatibilní, železem nezatížené průtokové cesty zvyšuje robustnost a opakovatelnost analýz bez nutnosti složitého pasivování či aditiv v mobilní fázi.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo porovnat analytický výkon Agilent 1290 Infinity II Bio LC (železo-volná cesta) a Agilent 1290 Infinity II LC (nerezová ocel) pro metabolomické aplikace. Hodnoceny byly aspekty jako adsorpce phosphorylovaných sloučenin, obraz píků, rozlišení isobarických metabolit a retenční časová přesnost.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky: intracelulární extrakty Saccharomyces cerevisiae z kontinuální kultivace za limitace glukózou a krátkodobé hladovění.
Extrakce: chloroform-metanolový protokol se stálou chlazenou vortexací a centrifugací, následné uchování vodné fáze při –70 °C.
Chromatografie: Agilent InfinityLab Poroshell 120 HILIC-Z PEEK-lined kolona 2.1×100 mm, gradient acetonitril/voda/500 mM acetát pH 9, průtok 0.3 mL/min, teplota 40 °C.
MS detekce: Agilent 6546 LC/Q-TOF v negativním režimu, rozsah m/z 25–1700, referenční masy pro kalibraci v reálném čase.

Hlavní výsledky a diskuse

Adsorpční testy: u Bio LC byla mezi dvěma po sobě jdoucími injekcemi ATP a GTP odchylka plochy jen 2–3 %, zatímco u standardního LC dosahovala 33–38 %, což potvrzuje eliminaci adhezivních interakcí.
Tvar píků: Bio LC vykázal výrazně nižší faktory tailingu (Tf) pro 15 phosphorylovaných metabolitů (např. ATP Tf 2.3 vs 4.0 u SST LC).
Rozlišení isobarů: Bio LC bezpečně oddělila G6P a F6P, zatímco SST LC vykazovala výrazné překrytí.
Opakovatelnost: retenční časy u Bio LC měly RSD kolem 0.1 % při 10 opakovaných injekcích reálných extraktů (G6P, F6P, AMP, ADP, ATP).
Biologické profily: během hladovění yeast extraktů klesala intenzita G6P, F6P a ATP a rostla AMP a ADP, což odráží změnu adenylátového náboje.

Přínosy a praktické využití metody

• Zlepšená robustnost a reproducibilita metabolomických analýz bez nutnosti pasivace.
• Vynikající tvar a rozlišení píků pro klíčové fosforylované sloučeniny.
• Spolehlivé stanovení energetického stavu buňky (adenylátový náboj).
• Zjednodušení provozu LC/MS laboratoří díky železo-volnému průtoku.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Široké nasazení biokompatibilních LC cest v rutinních metabolomických platformách a v klinické diagnostice.
• Integrace s vysoce výkonnými detektory a automatizovanými workflow pro rychlé profilingy.
• Vývoj nových stacionárních fází optimalizovaných pro citlivé a isobarické metabolity.
• Možnost real-time měření metabolických fluxů v bioreaktorových systémech.

Závěr

Agilent 1290 Infinity II Bio LC prokázal výraznou výhodu před standardním nerezovým systémem v oblasti adsorpce, tvaru píků, rozlišení isobar a přesnosti retenčních časů. Je ideální volbou pro vysoce kvalitní a robustní metabolomické aplikace.

Reference

1. Fiehn O., Weckwerth W. Deciphering metabolic networks. Eur. J. Biochem. 2003;270:579–588.
2. Feith A. et al. HILIC-Enabled 13C Metabolomics Strategies… Metabolites. 2019;9:63.
3. Wakamatsu A. et al. A Severe Peak Tailing of Phosphate Compounds… J. Sep. Sci. 2005;28:1823–1830.
4. Hsiao J. et al. Improved LC/MS Methods… Anal. Chem. 2018;90:9457–9464.
5. Weaver D. et al. A genome-scale metabolic flux model of E. coli K-12… BMC Syst. Biol. 2014;8:79.
6. De la Fuente I. et al. On the Dynamics of the Adenylate Energy System… PLoS One. 2014;9:e108676.