New Quadrupole-Ion Trap-Orbitrap Mass Spectrometer Combined with Real Time Search Enhances Proteome Coverage and Quantification Accuracy in Multiplexing Workflows

Význam tématu

Multiplexní kvantifikace proteinů pomocí izobarických činidel TMT představuje klíčovou metodu v proteomice pro souběžné porovnání více vzorků.
Hlavní výzvou je interference způsobená koizolovanými peptidy v MS2, která snižuje kvantitativní přesnost a hloubku pokrytí proteomu.
Real-time search (RTS) integrovaný do platformy Orbitrap Eclipse nabízí inteligentní rozhodování o spouštění MS3 skenů, čímž zlepšuje citlivost a přesnost měření.

Cíle a přehled studie

Hlavním cílem bylo otestovat výkon nového kvadrupól-ion trap-Orbitrap spektrometru s RTS v TMT workflow.
Porovnání tří režimů akvizice: MS2, SPS-MS3 a RTS-SPS-MS3 na standardu TMT11plex kvasinkové štěpné směsi.
Další validace na frakcionovaných TMT10plex vzorcích buněčné linie 293T a depleovaných plazmatických vzorcích.
Komparace TMT-RTS-MS3 a metody DIA na stejném analytickém čase.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky:

• Thermo Scientific Pierce TMT11plex kvasinkový digest standard
• TMT10plex značené 293T buňky a depleovaná lidská plazma
• Spike-in směs 6 proteinů v různých poměrech

Akvizice:

• Režimy MS2, SPS-MS3 a RTS-SPS-MS3 na Orbitrap Eclipse Tribrid
• DIA akvizice na neoznačených vzorcích

Analýza dat:

• Proteome Discoverer 2.4 pro TMT data (10 ppm MS1, 0,6 Da MS2, FDR 1 %)
• DIA-NN pro DIA data

Hlavní výsledky a diskuse

RTS-SPS-MS3 dosáhl kvantifikace ~1500 bílkovin ze standardu TMT11plex, oproti ~900 u SPS-MS3 a ~650 u MS2.
Interference free index (IFI) se zlepšil o ~20 % ve prospěch RTS-SPS-MS3.
V 24hodinové analýze TMT10plex 293T vzorku bylo identifikováno 9728 proteinů a >80000 peptidových skupin.
V plazmovém vzorku TMT10plex 18h bylo kvantifikováno 1411 proteinů, výrazně více než u DIA (809 proteinů).
DIA prokázala vyšší kvantitativní přesnost, avšak nižší proteomovou hloubku.

Přínosy a praktické využití metody

RTS-SPS-MS3 kombinuje vysokou proteomovou hloubku s výrazně lepší kvantitativní přesností v multiplexních experimentech.
Inteligentní volba fragmentů pro MS3 šetří čas přístroje a zvyšuje počet použitelných skenů.
Metoda je vhodná pro studiové nastavení vyžadující rozsáhlé porovnání vzorků (klinické, farmakologické či biologické aplikace).

Budoucí trendy a možnosti využití

• Další integrace real-time search do pokročilých instrumentálních platforem
• Kombinace RTS-TMT a DIA pro ideální kompromis mezi hloubkou a přesností
• Automatizované workflow s AI řízenou optimalizací parametrů akvizice
• Širší využití ve vysoce komplexních biologických matriích a klinických studiích

Závěr

RTS-SPS-MS3 na Orbitrap Eclipse představuje nový standard pro DDA kvantifikaci ve workflows využívajících TMT, s nejvyšší dosaženou hloubkou proteomu a kvantitativní přesností.
Doplňková DIA analýza poskytuje ověření výsledků a další dimenzi kontroly kvality kvantifikace.

Reference

1. Erickson BK et al. Active instrument engagement combined with a real-time database search for improved performance of sample multiplexing workflows. J Proteome Res. 2019;18(3):1299-1306.
2. Wiśniewski JR et al. Universal sample preparation method for proteome analysis. Nat Methods. 2009;6(5):359-362.
3. Demichev V et al. DIA-NN: neural networks and interference correction enable deep proteome coverage in high throughput. Nat Methods. 2020;17(1):41-44.
4. Paulo JA et al. A triple knockout (TKO) proteomics standard for diagnosing ion interference in isobaric labeling experiments. J Am Soc Mass Spectrom. 2016;27(10):1620-1625.